楊 曼，劉 海，張 潤，胡紫平，牛乃琪，王立賢，張龍超

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.北京黑六牧業(yè)科技有限公司，北京 102211)

豬肉是人類重要的食物來源之一，全球肉類消費(fèi)量的40%都是豬肉[1]。肉質(zhì)是一項(xiàng)綜合指標(biāo)，主要包括酸堿度(pH)、滴水損失、肉色、嫩度、水分含量、大理石花紋和肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)含量[2]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者開始尋求更美味、更健康、更安全和更有營養(yǎng)的豬肉，豬肉品質(zhì)越來越受到重視。因此，改善肉質(zhì)是當(dāng)代豬育種工作中的重要任務(wù)[3-4]。肉質(zhì)作為復(fù)雜數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，在品種間及品種內(nèi)均有一定的遺傳差異[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，在萊蕪豬群體中肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MYH)家族的MYH1、MYH2、MYH3和MYH13是與肉質(zhì)相關(guān)的候選基因[6]。MYH是肌球蛋白的重要組成部分，在動(dòng)物肌肉和骨骼生長發(fā)育等方面具有重要作用。MYH3和MYH13是MYH家族的重要成員，位于豬12號染色體上，可以調(diào)控肌球蛋白重鏈，影響肌肉收縮速度[7]。MYH家族的研究先前主要集中在與骨骼肌相關(guān)的疾病和對生長性狀的影響方面[8-10]，近年來育種者們發(fā)現(xiàn)MYH家族通過影響肌纖維類型對肉品質(zhì)產(chǎn)生很大影響[11-12]。Albuquerque等[13]在2個(gè)葡萄牙地方品種豬Alentejano和Bísaro背最長肌樣本中通過RNA-Seq方法篩選到49個(gè)差異基因，其中包括MYH3基因，表明MYH3基因可能與2個(gè)豬品種肉質(zhì)相關(guān)。Hou等[14]對長白豬、通城豬和五指山豬背最長肌樣品進(jìn)行RNA-Seq分析，同樣在差異基因中發(fā)現(xiàn)了MYH3基因，表明了MYH3基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的重要性。秦一禾[15]對601頭F2代豬個(gè)體進(jìn)行與IMF相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，共發(fā)現(xiàn)6 833個(gè)極顯著SNPs，其中6 680個(gè)定位到12號染色體上約10 Mb區(qū)間內(nèi)，MYH3、MYH13基因均在該區(qū)間內(nèi)，可能影響IMF含量。

北京黑豬是由通縣豬、深縣豬等本地豬與巴克夏豬、蘇聯(lián)大白豬雜交選育而成的培育豬種[16]，特別是在華北和東北市場因其獨(dú)特的肉質(zhì)風(fēng)味深受消費(fèi)者喜歡，對中國地方豬產(chǎn)業(yè)化有著重要的市場作用。目前，對北京黑豬的研究主要集中在生產(chǎn)性能、屠宰測定等方面[16-17]，有關(guān)MYH3和MYH13候選基因及其多態(tài)性與肉質(zhì)性狀之間調(diào)控方式的研究報(bào)道較少。鑒于此，本試驗(yàn)對北京黑豬MYH3、MYH13基因的啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，對篩選的SNP位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探索北京黑豬中MYH3、MYH13基因調(diào)控肉質(zhì)性狀變異的候選功能位點(diǎn)，為探尋北京黑豬肉質(zhì)的遺傳機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣品及表型數(shù)據(jù)的采集

413頭北京黑豬由北京黑六牧業(yè)科技有限公司提供，屠宰后采集其左半胴體倒數(shù)第3―4胸椎后背最長肌樣品20～30 cm，根據(jù)美國國家豬肉生產(chǎn)者委員會(NPPC)的標(biāo)準(zhǔn)指南，對屠宰后24 h的北京黑豬個(gè)體背最長肌樣本測定7個(gè)肉質(zhì)性狀(IMF、水分、滴水損失、pH、肉色L*值(明度)、肉色a*值(紅色)、肉色b*值(黃色))。使用Hanna HI8424NEW pH計(jì)于屠宰后24 h測定pH；使用CR-410型美能達(dá)色度儀于屠宰后24 h對背最長肌切面上的肉色(L*、a*和b*值)進(jìn)行評估；使用乙醚提取法測量IMF含量。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒(DNA Mini Kit)購自QIAamp公司；RNA提取試劑盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimerScript RT)及熒光定量試劑盒(TB Green Premix ExTaq)均購自TaKaRa公司。

1.3 DNA及RNA提取

采用DNA及RNA提取試劑盒提取組織樣品DNA及RNA，利用超微量分光光度計(jì)測定樣品濃度，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳測定樣品質(zhì)量，對質(zhì)量合格的DNA于―20 ℃保存?zhèn)溆茫琑NA于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件對MYH3(登錄號：XM_013981330.2)、MYH13(登錄號：XM_021066284.1)基因外顯子及基因5′-端2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)共設(shè)計(jì)85對PCR引物及2對實(shí)時(shí)熒光定量引物，以GAPDH(登錄號：XM_021091114.1)為內(nèi)參基因，部分引物見表1、2。引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 部分PCR引物信息

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.5 PCR擴(kuò)增及測序

以北京黑豬DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸30～90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后切膠回收，送北京六合華大基因科技有限公進(jìn)行雙向Sanger測序。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選候選位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，按照SNP基因型挑選個(gè)體進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA (1 μg)反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄分為兩步，第一步反應(yīng)體系共10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL，總RNA 1 μg，RNase-free ddH2O補(bǔ)足體系。42 ℃ 2 min。第二步反應(yīng)體系共20 μL：步驟一的反應(yīng)液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，RT Primer Mix 4 μL，5×PrimeScript Buffer 2 (for Real-time) 4 μL，RNase-free ddH2O 1 μL。37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR將檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平歸一化。PCR反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，定量結(jié)果采用2―△△Ct法計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DNAStar中的SeqMan生物軟件對PCR測序結(jié)果進(jìn)行基因分型，并對基因型頻率和基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用SAS 9.2軟件中t檢驗(yàn)TTEST程序?qū)?shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析；使用SAS 9.2軟件以性別、場、日齡作為協(xié)變量對表型與基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用協(xié)方差分析GLM程序來評估不同基因型之間的顯著性。以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。模型如下：

yij=β0i+βxij+εij

式中，yij，性狀觀察值；β0i，第i組回歸線的截距；β，相關(guān)的回歸系數(shù)；xij，協(xié)變量；εij，隨機(jī)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 表型數(shù)據(jù)描述

北京黑豬個(gè)體肉質(zhì)性狀的表型值見表3。由表3可知，肌內(nèi)脂肪、pH、肉色L*值、肉色a*值、肉色b*值、水分含量及滴水損失的平均值分別為2.03%、5.81、54.90、14.05、3.72、73.49%和0.50%，整體變異系數(shù)為0.02%～1.30%。

表3 肉質(zhì)性狀的表型值統(tǒng)計(jì)

2.2 MYH3和MYH13基因的基因型頻率及基因頻率

通過對2個(gè)基因外顯子及啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNPs，其中5個(gè)SNPs位于基因CDS區(qū)，4個(gè)SNPs位于啟動(dòng)子區(qū)，包含1個(gè)MYH3基因的錯(cuò)義突變(c.5782 G>C)、4個(gè)MYH13基因的同義突變(c.1923 G>A、c.1308 G>A、c.963 G>A、c.237 G>T)和4個(gè)MYH13基因啟動(dòng)子區(qū)突變(rs321315318、rs330770991、rs699287502、rs318639161)；9個(gè)SNPs的基因型頻率變化范圍為0.01～0.87,其等位基因頻率變化范圍0.08～0.92(表4)。

表4 北京黑豬MYH3和MYH13基因的基因型頻率和基因頻率

2.3 MYH3和MYH13基因9個(gè)SNPs對北京黑豬肉質(zhì)性狀的影響

北京黑豬MYH3和MYH13基因9個(gè)SNPs位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。由表5可知，MYH3基因的c.5782 G>C錯(cuò)義突變與IMF含量顯著相關(guān)，其中GC基因型個(gè)體IMF含量顯著高于GG和CC基因型(P<0.05)，且GG基因型個(gè)體IMF含量高于CC基因型(P>0.05)。MYH13基因上2個(gè)同義突變(c.1923 G>A、c.1308 G>A)與肉色a*值顯著相關(guān)，其中GA基因型個(gè)體肉色a*值顯著低于GG和AA基因型(P<0.05)；1個(gè)同義突變(c.963 G>A)與滴水損失顯著相關(guān)，其中AA基因型個(gè)體滴水損失顯著低于GG和GA基因型(P<0.05)；1個(gè)同義突變(c.237 G>T)與肉色L*值顯著相關(guān)，其中GT基因型個(gè)體肉色L*值顯著高于GG基因型(P<0.05)。MYH13基因啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)SNPs(rs321315318、rs330770991)與滴水損失顯著相關(guān)，其中rs321315318位點(diǎn)TT基因型個(gè)體滴水損失顯著高于AA和AT基因型，rs330770991位點(diǎn)TT基因型個(gè)體滴水損失顯著高于GG和GT基因型(P<0.05)；2個(gè)SNPs(rs699287502、rs318639161)與肉色L*值顯著相關(guān)，其中rs699287502位點(diǎn)CT基因型個(gè)體肉色L*值顯著低于CC和CT基因型，rs318639161位點(diǎn)CT基因型個(gè)體肉色L*值顯著高于TT基因型(P<0.05)。

表5 MYH3和MYH13基因9個(gè)SNPs與北京黑豬肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4 MYH3和MYH13基因SNPs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

MYH13基因啟動(dòng)子rs321315318位點(diǎn)AA基因型與rs330770991位點(diǎn)GG基因型連鎖，rs321315318位點(diǎn)TT基因型與rs330770991位點(diǎn)TT基因型連鎖，即MYH13基因啟動(dòng)子rs321315318位點(diǎn)AA基因型個(gè)體rs330770991位點(diǎn)為GG基因型，MYH13基因啟動(dòng)子rs321315318位點(diǎn)TT基因型個(gè)體rs330770991位點(diǎn)為TT基因型。為驗(yàn)證SNPs的準(zhǔn)確性，選取MYH3錯(cuò)義突變(c.5782 G>C)和MYH13基因啟動(dòng)子(rs321315318、rs330770991)純合基因型個(gè)體各4頭，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MYH3基因錯(cuò)義突變(c.5782 G>C)GG基因型個(gè)體基因表達(dá)量極顯著高于CC基因型(P<0.01，圖1A)；MYH13基因啟動(dòng)子rs321315318位點(diǎn)AA基因型個(gè)體基因表達(dá)量顯著高于TT基因型，rs330770991位點(diǎn)GG基因型個(gè)體基因表達(dá)量顯著高于TT基因型(P<0.05，圖1B)。

①由于rs321315318位點(diǎn)與rs330770991位點(diǎn)連鎖，AA-GG為rs321315318位點(diǎn)AA基因型或rs330770991位點(diǎn)GG基因型；由于rs321315318位點(diǎn)與rs330770991位點(diǎn)連鎖，TT-TT為rs321315318位點(diǎn)TT基因型或rs330770991位點(diǎn)TT基因型。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

候選基因法是鑒定已知基因與性狀之間關(guān)系的有效方法，不僅費(fèi)用低，而且鑒定精確，已有研究利用候選基因法鑒定出ENO3基因中9個(gè)SNPs與大白豬生長性狀呈顯著相關(guān)[18]。MYH3和MYH13基因是肉質(zhì)的重要基因，但其調(diào)控機(jī)制及調(diào)控位點(diǎn)尚不清楚。本研究通過候選基因法精確定位MYH3和MYH13基因中重要SNP，通過基因表達(dá)進(jìn)一步探究位點(diǎn)對基因的調(diào)控作用，闡明MYH3和MYH13基因調(diào)控肉質(zhì)性狀的分子機(jī)制，為基因調(diào)控提供分子證據(jù)。

肌球蛋白由2個(gè)肌球蛋白重鏈和4個(gè)肌球蛋白輕鏈組成，通過水解ATP可以將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，為肌肉收縮做出貢獻(xiàn)，是肌肉組織的重要組成部分[19-20]。MYH是肌球蛋白的重要組成部分，包含18個(gè)成員，編碼與肌肉相關(guān)的MyHC蛋白亞型。MYH3基因在肌肉發(fā)育的整個(gè)過程中都具有非常重要的影響[10]，MYH3基因可以通過MAPK及TGF-β信號通路調(diào)控下游蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而影響肌肉代謝[21-22]，目前MYH3基因已經(jīng)成為檢測肌肉發(fā)育和肌細(xì)胞分化的重要標(biāo)志基因[23]。MYH3和MYH13基因作為MYH家族重要基因，其多態(tài)性與肉質(zhì)性狀之間存在關(guān)聯(lián)。Lee等[24]在長白豬×韓國本地豬雜交的1 105頭F2代群體中，利用GWAS及連鎖不平衡方法確定12號染色體上749.1 kb區(qū)間內(nèi)MYH3基因?yàn)楹蜻x基因，認(rèn)為MYH3基因可通過影響脂肪酸組成來影響肉質(zhì)。除此之外，Cho等[25]對韓國本地豬分別與長白豬和杜洛克豬雜交產(chǎn)生的F2代群體進(jìn)行GWAS和連鎖不平衡分析，認(rèn)為12號染色體上488.1 kb關(guān)鍵區(qū)間內(nèi)的MYH3基因可作為影響該群體IMF含量及肉色a*值的候選基因。Huang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，MYH3基因啟動(dòng)子區(qū)存在6 bp的變異(登錄號：XM_013981330.2：g.-1805_-1810del)，缺失(Q)等位基因個(gè)體的IMF含量和肉色a*值均顯著高于野生型(q)等位基因個(gè)體，6 bp缺失影響MYH3基因的表達(dá)從而調(diào)控豬的肌纖維類型及IMF含量。本研究發(fā)現(xiàn)，在北京黑豬群體中MYH3基因CDS區(qū)的1個(gè)錯(cuò)義突變(c.5782 G>C)與IMF含量顯著相關(guān)，但與肉色及其他肉質(zhì)性狀均無顯著關(guān)聯(lián)。

MYH13基因在維持肌肉正常功能方面發(fā)揮重要作用。Guo等[27]在557頭大白豬×民豬F2代資源群體中利用60K SNP芯片數(shù)據(jù)及眼肌面積表型數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS，MYH3和MYH13基因均被確定為影響眼肌面積的候選基因。宿英等[28]對624頭嵌合家系F7代個(gè)體的重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS，發(fā)現(xiàn)MYH3和MYH13基因?qū)θ馍哂酗@著效應(yīng)。Xiong等[6]利用GWAS方法確定MYH3和MYH13基因與萊蕪豬肉質(zhì)相關(guān)。本試驗(yàn)中，北京黑豬群體共發(fā)現(xiàn)4個(gè)MYH13基因CDS區(qū)突變，其中2個(gè)SNPs(c.1923 G>A、c.1308 G>A)與肉色a*值顯著相關(guān)，1個(gè)SNP(c.963 G>A)與滴水損失顯著相關(guān)，1個(gè)SNP(c.237 G>T)與肉色L*值顯著相關(guān)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)4個(gè)MYH13基因啟動(dòng)子區(qū)突變，其中2個(gè)SNPs(rs321315318、rs330770991)與滴水損失顯著相關(guān)；2個(gè)SNPs(rs699287502、rs318639161)與肉色L*值顯著相關(guān)。表明MYH3、MYH13基因的多態(tài)性位點(diǎn)與北京黑豬肉色L*值、肉色a*值、滴水損失等肉質(zhì)性狀存在關(guān)聯(lián)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，MYH3基因CDS區(qū)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)(c.5782 G>C)與IMF含量表型趨勢一致，其基因型與表型關(guān)聯(lián)中純合基因型間IMF含量雖未達(dá)到顯著水平，但GG基因型個(gè)體IMF含量有高于CC基因型個(gè)體的趨勢，可能是由于MYH3基因高表達(dá)上調(diào)了IMF含量。MYH13基因啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)(rs321315318、rs330770991)突變與滴水損失表型趨勢相反，MYH13基因表達(dá)量高的個(gè)體滴水損失更低，肉品質(zhì)更好，這2個(gè)SNPs可能是滴水損失性狀的調(diào)控位點(diǎn)，或與調(diào)控位點(diǎn)連鎖。本研究結(jié)果可為北京黑豬的后續(xù)選育提供一定的數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

通過對北京黑豬群體中MYH3、MYH13基因及其啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性研究及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNPs，其中，MYH3基因上1個(gè)SNP與IMF含量顯著相關(guān)，且該基因表達(dá)量與IMF含量呈正相關(guān)；MYH13基因上8個(gè)SNPs分別與滴水損失、肉色L*值以及肉色a*值顯著相關(guān)，其中啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)SNPs與肉色L*值顯著相關(guān)；2個(gè)SNPs與滴水損失顯著相關(guān)，且基因表達(dá)量與滴水損失值呈負(fù)相關(guān)。