湯喬偉 胡鈞 樊春海 諸穎

“光”是生活中不可或缺的資源，人類的發(fā)展歷程離不開光的使用。早在2 400年前的古希臘，亞里士多德就對光產(chǎn)生了思考，雖然其理論后續(xù)被證實是錯誤的，但還是對光的研究產(chǎn)生了深遠的影響。生活中肉眼可見的光是“可見光”，根據(jù)波長的不同，光還可以分為無線電波、紅外、紫外、X射線和Y射線等。

當可見光照射人體時，會有一部分光反射到我們的眼睛中，所以我們“看到”了他人。但是當X射線照射到人體時，則會穿透人體，通過X光底片記錄不同角度穿透人體的程度，就可以復原人體內(nèi)部的結構。這也是臨床中X光電子計算機斷層掃描（CT）的原理。

如何利用“光”幫助研究大腦呢？臨床中醫(yī)生通過X光CT對頭部進行掃描研究腦的結構與形態(tài)，觀察其病變情況；光遺傳學中，研究光調(diào)控神經(jīng)元的活動；鈣成像中，研究者通過觀察“閃爍”的神經(jīng)元記錄其活動；熒光成像中，研究者通過向動物大腦注射病毒使神經(jīng)元發(fā)出“熒光”從而觀察神經(jīng)元的形態(tài)。諸如此類的方法還有很多， “光”伴隨著大腦的研究。我們在這里重點介紹利用基于同步輻射光源的X射線成像對大腦，尤其是神經(jīng)元結構進行的研究。

從二維到三維神經(jīng)元成像

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結構和功能單位，對大腦的研究離不開對神經(jīng)元的研究。1873年卡米洛·高爾基（Camillo Golgi）發(fā)明了高爾基染色法，染色后神經(jīng)元呈現(xiàn)黑色，首次展現(xiàn)了神經(jīng)元的結構。接著，卡哈爾（Cajal）對高爾基染色法進行了完善，使其更好地應用于神經(jīng)科學研究。1906年，高爾基和卡哈爾被共同授予諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

人類大腦中約有上千億個神經(jīng)元，每個神經(jīng)元又會和成百上千個神經(jīng)元通過突觸連接。想要分析這些神經(jīng)元如何整合成一個系統(tǒng)并發(fā)揮作用，繪制“大腦地圖”是重要的突破點。我們知道，繪制道路地圖需要標明地點和道路，繪制“大腦地圖”也一樣。神經(jīng)元的胞體像是地點，神經(jīng)元之間的連接像是道路。而繪制地圖則離不開對神經(jīng)元結構的成像。

受限于技術，研究者在早期對神經(jīng)元的成像更多停留在二維的組織切片中。對神經(jīng)元的二維成像取得了出色的成果，如1954年利用電子顯微鏡第一次觀察到突觸間隙，從而證明卡哈爾的神經(jīng)系統(tǒng)結構模式理論的正確性。隨著技術不斷發(fā)展，研究者更希望在三維層面上觀察神經(jīng)元，于是三維成像技術開始應用于神經(jīng)元成像中。從早期的核磁共振成像、CT成像等技術，到近些年來發(fā)展的連續(xù)切片電子顯微鏡（SSEM）、顯微光學斷層掃描系統(tǒng)（MOST）等，在不同尺度上為人們揭開了神經(jīng)元的神秘面紗。正因為有了這些技術，繪制“大腦地圖”成為可能。

繪制人類“大腦地圖”的挑戰(zhàn)

繪制“大腦地圖”容易嗎？1986年，研究者通過電子顯微鏡成像繪制出了線蟲的第一張大腦全連線圖，線蟲擁有302個神經(jīng)元，這項工作耗費了整整15年的時間。近年來，計算機技術的發(fā)展和成像設備的更新?lián)Q代使得獲得圖像的速度大幅度提升，但對于繪制人類“大腦地圖”還需要進一步提升成像速度。

2021年，哈佛和谷歌的研究團隊通過電子顯微鏡以4 nm的分辨率對人類大腦皮層進行了約5 000片30 nm厚的連續(xù)掃描，完成了“百萬分之一”人腦神經(jīng)三維連接圖譜。盡管樣品僅有針頭大小，但其中耗費的時間和精力是難以想象的。該圖譜的數(shù)據(jù)量也達到了驚人的1.4 PB，如果用市面上常見的512 GB儲存空間的筆記本電腦來存儲數(shù)據(jù)，要使用近3 000臺電腦。所以，按照當前的技術水平，利用電子顯微鏡來獲取完整的人腦神經(jīng)三維連接圖譜是不可能的。

2010年，MOST的問世給研究大腦三維結構帶來了巨大的便利，MOST可在數(shù)天內(nèi)完成介觀尺度下小鼠大腦的三維成像。2022年，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心和華中科技大學的研究團隊合作，對小鼠前額葉皮層的6 357個神經(jīng)元進行成像，構建了最大的小鼠前額葉單神經(jīng)元投射圖譜。MOST的成像速度和高分辨能力使其廣泛地應用于小鼠等模式動物的全腦成像及圖譜構建。但是，面對人腦如此大的體量，使用MOST獲取數(shù)據(jù)也需要耗費大量時間。

近些年來從事腦科學的研究者關注到了基于同步輻射光源的X射線成像技術，并應用到神經(jīng)元的成像中，那基于同步輻射光源的X射線成像技術有何優(yōu)勢呢？

同步輻射光源的X射線

當帶電粒子在電磁場中以接近光速的速度沿曲線軌道運動時，會在其運動的切線方向發(fā)出電磁輻射。由于它最初在同步加速器上被發(fā)現(xiàn)，故被稱為“同步輻射”。從同步輻射裝置問世至今已出現(xiàn)了四代裝置。第一代是依托于高能物理研究的加速器；第二代專門為同步輻射應用設計；第三代擁有更高的亮度，更好的時間分辨率和空間分辨率；第四代是自由電子激光器。相比較于傳統(tǒng)光源，同步輻射光源擁有高亮度、高準直性和高偏振等優(yōu)勢，并且覆蓋了從遠紅外到X射線波段的連續(xù)光譜。

第二、三、四代同步輻射光源原理圖

X射線由德國科學家倫琴在19世紀末發(fā)現(xiàn)，其擁有豐富的輻射-物質(zhì)相互作用，包括吸收、衍射、散射和熒光等相互作用?；诖碎_發(fā)了一系列的實驗方法：X射線吸收成像、X射線衍射、小角X射線散射和X射線熒光等。想要“看清”神經(jīng)元、蛋白質(zhì)和病毒等微小結構就需要選擇波長較短的光。X射線波長短，是探索微觀世界的重要工具。

通過X-PCI成像后三維可視化的浦肯野細胞及分子層和顆粒層細胞

基于同步輻射光源的X射線具有高準直性，可近似平行光入射，并且具有高純凈性，無雜質(zhì)污染。同步輻射X光應用于神經(jīng)元成像最大的優(yōu)勢在于其高亮度，第三代同步輻射光源的X射線亮度是X光機的上億倍。這不僅提升了X射線的穿透深度，同時也減少了曝光時間，大幅度提升了獲取成像數(shù)據(jù)的速度。

基于同步輻射光源的X射線成像

目前已有一系列基于同步輻射光源的X射線成像技術應用到神經(jīng)元成像的相關研究中，其中應用最廣泛的是硬X射線的相關技術。硬X射線的波長在0.01 nm到0.1 nm，相較于波長較長的軟X射線，其具有更高的穿透能力?；谕捷椛涔庠吹腦射線相襯成像（X-PCI）、微米X射線斷層掃描（Micro-CT）和X射線納米全息層析成像（XNH）等相關技術在神經(jīng)元結構的成像中發(fā)揮了重要的作用。

X-PCI技術利用軟組織樣品對X射線相位信息的響應，獲得X射線對比度，從而實現(xiàn)對神經(jīng)元的無標記成像。該技術對神經(jīng)元的胞體以及浦肯野細胞等具有較好的成像效果，并可同時成像神經(jīng)元和血管。近年來，有研究者利用X-PCI對無標記的人類小腦進行研究，對位于不同腦區(qū)的神經(jīng)元胞體進行分布研究，并且從數(shù)據(jù)集中分割出浦肯野細胞。

XNH技術根據(jù)樣品引起光束細微相移的變化來獲取圖像，并結合全息和層析重建來獲取圖像。該技術分辨率高，各向同性體素分辨率可以達到25 nm，且成像速度快，通過XNH技術可在12小時內(nèi)完成各向同性分辨率50 nm的果蠅全腦成像。2020年，哈佛的研究者通過XNH掃描追蹤了果蠅肌肉到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單根運動軸突，證明了XNH的快速成像和追蹤能力。

Micro-CT基于硬X射線吸收成像。由于硬X射線對高原子序數(shù)的元素有強吸收，而對碳、氫、氧等低原子序數(shù)的元素吸收很弱，所以利用Micro-CT對神經(jīng)元成像需要對神經(jīng)元染色。高爾基染色法的染液中含有汞、鉻等高原子序數(shù)元素，對硬X射線有強吸收，從而擁有出色的X射線對比度。研究者通過Micro-CT在幾分鐘內(nèi)完成了對果蠅大腦各向同性分辨率300 nm的數(shù)據(jù)采集，并在數(shù)天內(nèi)完成了小鼠大腦的數(shù)據(jù)集采集。

通過Micro-CT成像后三維可視化的果蠅頭部

除了上述技術之外，基于同步輻射的透射X射線顯微（TXM）技術也可用于神經(jīng)元成像。該技術采用空心環(huán)形光照明，空間分辨率和成像視場僅受菲涅爾波帶片的限制。TXM的分辨率高且成像速度快，已有研究者實現(xiàn)了1分鐘50 nm空間分辨率的納米層析成像，并有分辨率小于10 nm的快速3D層析成像（85 分鐘），這一分辨率已經(jīng)逼近了電子顯微鏡常用的4 nm分辨率。目前，已有通過TXM觀測神經(jīng)元軸突和樹突棘的報道，相信不久的未來，TXM技術將廣泛應用于神經(jīng)元成像。

同步輻射X射線成像是繪制“大腦地圖”的利器

基于同步輻射光源的X射線成像相比較于其他三維成像技術有其獨特的優(yōu)勢：

（1）同步輻射光源的X射線具有高亮度，這保證了其穿透深度，在此前的報道中發(fā)現(xiàn)其可以穿透數(shù)毫米的未透明化的腦組織塊，降低了多組數(shù)據(jù)配準的工作量和難度。

（2）該方法具有各向同性分辨率，尤其是Z軸上具有高分辨率。光學成像方法中提高Z軸分辨通常需要減少切片和光學切片的厚度，使得采樣的時間大幅度增加。

（3）該方法樣品制備簡單，無需對樣品透明化處理和薄切片，通過XNH和X-PCI技術，還可以實現(xiàn)無標記的神經(jīng)元成像，最大程度保證了樣品的完整性并可用于后續(xù)的其他研究。

（4）向腦區(qū)注射病毒是熒光成像中常用的手段，但這不能應用于人腦中?；谕捷椛涔庠吹腦射線成像可以使用高爾基染色或鋨酸染色，而此類染色方法可對死亡后的人腦組織進行固定和染色。不同于熒光成像，基于同步輻射光源的X射線成像無光漂白現(xiàn)象，并且可以長時間成像和反復成像。

（5）基于同步輻射光源的X射線成像獲取數(shù)據(jù)速度快，就Micro-CT而言，成像速度目前最快可以達到1mm3/min組織，是目前成像速度最快的三維成像手段。

繪制人類“大腦地圖”的機遇與挑戰(zhàn)

繪制“人腦地圖”是一個巨大的工程，現(xiàn)階段無法通過單課題組完成。由中國上海光源（SSRF）、中國臺灣同步輻射研究中心（NSRRC）、韓國浦項光源（Pohang Light Source）、新加坡光源中心（SSLS）、日本Spring-8光源、澳大利亞以及泰國光源等共同成立的大科學裝置群的同步輻射神經(jīng)科學亞太聯(lián)盟（SYNAPSE），旨在繪制全世界首幅人全腦介觀X射線連接圖譜成像。以目前1 mm3/min的成像速度，十條相關同步輻射X射線成像線站協(xié)作，完成人全腦介觀尺度X射線成像所用時間不到90天。

現(xiàn)階段仍有一系列問題需要攻克，例如大數(shù)據(jù)的處理和配準、高爾基染色方法的改良等。先進的同步輻射大科學裝置群的協(xié)作加上一系列染色、數(shù)據(jù)處理技術的支持和突破，繪制人類“大腦地圖”將只是時間問題，基于同步輻射光源的X射線成像技術將是完成這一偉大工程的利器。