魏攀鳳 張小燕

根據(jù)全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌（colorectal cance,CRC）的發(fā)病率和死亡率在近年來一直處于明顯上升趨勢(shì)，在全球癌癥中位居第三，死亡率第二。從疾病發(fā)展趨勢(shì)角度根據(jù)不同年齡和區(qū)域進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，年輕人的患病率升高，且與往年發(fā)病水平相比發(fā)病率有所上升。CRC發(fā)生和后續(xù)發(fā)展與環(huán)境、遺傳因素、不良飲食結(jié)構(gòu)、腸道微生物群體失衡[1-2]、腸黏膜發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)等有關(guān)，各種危險(xiǎn)因素相互作用而引起機(jī)體結(jié)直腸惡性腫瘤的產(chǎn)生[3]。具核梭桿菌（fusobacterium nucleatum, Fn）是CRC發(fā)生的可疑病原體之一，具體的致病機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。目前，有報(bào)道指出Fn的腸道感染途徑為通過致病菌異常定植在腸道黏膜中致使腸黏膜發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)[4]，并激活機(jī)體免疫應(yīng)答從而導(dǎo)致惡性細(xì)胞生成，F(xiàn)n與CRC發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，Cuellar-Gómez等[5]的研究表明，在CRC患者中Fn明顯富集的患者淋巴轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率均高于平均水平。

二甲雙胍是目前全球臨床上應(yīng)用最為廣泛的2型糖尿病口服藥物，進(jìn)入機(jī)體后主要分布于肝臟，藥物作用機(jī)制是抑制肝臟葡萄糖異生。目前有實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍聯(lián)合抗腫瘤藥物使用能使細(xì)胞周期停滯[6-8]，異常激活A(yù)MPK通路和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等通路[9]。其還可通過降低機(jī)體胰島素水平起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和有絲分裂[10]，減少機(jī)體脂肪組織生成從而抑制由脂肪細(xì)胞介導(dǎo)的惡性腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移。Huang等[11]給予4～5周的小鼠二甲雙胍（250 mg/kg）每天口服灌喂和Fn（109菌落單位）每周2次共同持續(xù)喂養(yǎng)12周，于18周后進(jìn)行結(jié)腸組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)給予二甲雙胍組結(jié)腸結(jié)瘤數(shù)減少、瘤體積較小，在組織學(xué)上減輕了Fn誘導(dǎo)瘤的形成。綜上表明二甲雙胍對(duì)腸道微生物組成和代謝功能障礙均有一定的影響，其可降低惡性細(xì)胞增殖，抑制腸道腫瘤形成和逆轉(zhuǎn)Fn誘導(dǎo)的腫瘤形成。

E-cadherin是一種Ca2+依賴黏附糖蛋白，為單程跨膜蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附。其表達(dá)缺失是細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）最重要的標(biāo)志性變化，也是上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、遷移的前提條件[12]。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可誘導(dǎo)CRC腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞-細(xì)胞黏附連接的重建[12-13]，表現(xiàn)為 E-cadherin、p120-catenin和β-catenin 定位修飾。且隨著黏著斑激酶（FAK）的抑制，毒力因子FadA黏附素與E-cadherin蛋白結(jié)合，激活β-catenin因子，介導(dǎo)致病菌附著和侵襲上皮細(xì)胞，刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人CRC細(xì)胞株SW480購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Fn ATCC25586菌株購自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Hyclone公司；二甲雙胍購自美國(guó)Sigma公司；兔抗人E-cadherin單克隆抗體購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將CRC標(biāo)準(zhǔn)菌株SW480細(xì)胞在10%胎牛血清和含抗DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、10% CO2培養(yǎng)，胰酶消化傳代生長(zhǎng)，配成8×105/ml的細(xì)胞懸液24孔板培養(yǎng)24 h后備用分組。Fn調(diào)節(jié)成濃度1×108/ml備用。將癌細(xì)胞密度配置為1×105接種直96孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分組，對(duì)照組：SW480組；Fn組：Fn+SW480組[細(xì)胞與菌比例按照感染復(fù)數(shù)（MOI）（100∶1）共培養(yǎng)]；二甲雙胍組：二甲雙胍+SW480（二甲雙胍5 mmol/L）；聯(lián)合組：二甲雙胍+Fn+SW480[細(xì)胞與菌比例按照MOI（100∶1），二甲雙胍5 mmol/L]。用MTT法采用吸光度OD值（490 nm）計(jì)算24 h、48 h、72 h活細(xì)胞數(shù)。另各組培養(yǎng)處理至48 h用Western blotting檢測(cè)法，以內(nèi)參的灰度值作為對(duì)比，取對(duì)比值作為E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次檢測(cè)取其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單向方差分析，兩兩比較用最小顯著差異法（LSD）t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)SW480增殖的影響

相對(duì)于對(duì)照組和Fn組，含二甲雙胍的培養(yǎng)組24 h、48 h及72 h均出現(xiàn)OD值明顯低于對(duì)照組和Fn組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 二甲雙胍對(duì)SW480增殖的影響(n=5,±s)

表1 二甲雙胍對(duì)SW480增殖的影響(n=5,±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與Fn組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 0.42±0.05 0.53±0.07 0.59±0.06 Fn組 0.45±0.02a 0.69±0.07a 0.85±0.07a二甲雙胍組 0.39±0.02ab 0.37±0.05ab 0.34±0.04ab聯(lián)合組 0.40±0.01ab 0.41±0.03ab 0.40±0.03ab F值 12.215 1 009.915 6 076.907 P值 0.02 0.000 0.000

圖1 二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

2.2 二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組和Fn組比較，二甲雙胍組、聯(lián)合組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表2 二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響(n=3,±s)

表2 二甲雙胍對(duì)SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響(n=3,±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與Fn組比較，bP＜0.05

組別 E-cadherin蛋白對(duì)照組 1.35±0.10 Fn組 1.21±0.02二甲雙胍組 1.86±0.10ab聯(lián)合組 1.62±0.15ab F值 23.775 P值 0.00

3 討論

CRC是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，病理機(jī)制目前尚未明確，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因。CRC的發(fā)生是多種因素造成的[14-15]。EMT是腫瘤細(xì)胞形成標(biāo)志物之一，并導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，無創(chuàng)有效的篩查和高效治療方案還未發(fā)現(xiàn)，因此探究CRC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制及轉(zhuǎn)歸對(duì)于未來制定預(yù)防、篩查和治療策略至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)通過建立二甲雙胍（5 mmol/L）與Fn和SW480（MOI：100∶1）共培養(yǎng)，記錄24 h、48 h、72 h的OD值，結(jié)果表明Fn可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖，二甲雙胍能抑制CRC的增殖；其作用在48～72 h明顯高于24 h。其可能的作用機(jī)制是二甲雙胍對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT具有抑制潛能。因E-cadherin是細(xì)胞EMT的主要標(biāo)志物，能表達(dá)致病體的侵襲和遷移能力從而逆轉(zhuǎn)EMT途徑[16-17]，故也被確定為疾病治愈的影響因素。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍可通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成抑制腸癌的發(fā)生[18]。二甲雙胍通過調(diào)節(jié)菌群起到抑制炎癥反應(yīng)促發(fā)細(xì)胞增殖途徑的潛在作用。本實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在聯(lián)合組中也體現(xiàn)減輕了Fn誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，考慮是否存在逆轉(zhuǎn)Fn誘導(dǎo)的致瘤性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin在聯(lián)合組中的表達(dá)量也比對(duì)照組和Fn組高，提示二甲雙胍可促使腫瘤細(xì)胞與E-cadherin結(jié)合，抑制Fn附著和侵入上皮細(xì)胞，從而降低CRC的發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，二甲雙胍可能通過促使腫瘤細(xì)胞與E-cadherin結(jié)合，抑制Fn附著和侵入上皮細(xì)胞，從而降低CRC的發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。