崔海峰，彭 博，馮淑怡，黃 穎，石曉路，武 乾，孫明杰，孫麗華△

(1.北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

阿霉素(adriamycin,ADM)為蒽環(huán)類(lèi)抗生素，因抗瘤譜廣、療效確切，廣泛用于腫瘤的化學(xué)治療。但ADM與心肌組織有高親和性，體內(nèi)累積劑量達(dá)到500～550 mg/m2時(shí)，充血性心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病甚至死亡的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)都顯著提高[1]。因此，預(yù)防和減輕阿霉素心肌毒性一直是臨床應(yīng)用首要考慮的問(wèn)題，也是近年來(lái)業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。生脈飲是傳統(tǒng)經(jīng)典方劑生脈散的不同劑型，由紅參、麥冬、五味子組成，能夠改善心肌供血，緩解心衰癥狀，增加化療藥物的抗腫瘤作用[2]，但其是否能夠在體外保護(hù)阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷至今鮮有報(bào)道?；诖?，本研究通過(guò)ADM損傷心肌細(xì)胞的體外模型，評(píng)價(jià)生脈飲對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，為生脈飲減輕ADM心肌毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

生脈飲由釣魚(yú)臺(tái)醫(yī)藥集團(tuán)吉林天強(qiáng)制藥股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z22022398，規(guī)格10 mL/支。

1.2 細(xì)胞株

H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞為本室傳代保存細(xì)胞株。

1.3 主要試劑及儀器

Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher公司，貨號(hào)SH30243.01)；Gibco胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)2094468CP)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(日本東仁化學(xué)品公司，cell counting kit-8,CCK-8，貨號(hào)PL702)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)20191127)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)20191127)；Bio Tek Synergy1型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-tek公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行[3，4]，配置含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，DMEM完全培養(yǎng)基。將H9c2細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中，輕輕搖動(dòng)凍存管使細(xì)胞懸液盡快融解并吸取細(xì)胞懸液，加入10倍培養(yǎng)基稀釋?zhuān)x心后去上清，重懸細(xì)胞沉淀于新鮮DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)應(yīng)用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代。

2.2 CCK-8檢測(cè)生脈飲對(duì)H9c2細(xì)胞活性的作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，按照8×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，接種體積100 μL，24 h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度生脈飲含藥培養(yǎng)液(0.39～1600 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度(optical density，OD)值，以空白孔OD值調(diào)0，對(duì)照組平均吸光值為100%，其余各組均與之比較。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。

2.3 CCK-8篩選阿霉素?fù)p傷最適濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組、不同濃度ADM組，24 h貼壁后加入不同濃度ADM(1.5625～100 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值，細(xì)胞存活率計(jì)算方法同2.2，確定H9C2損傷模型最適ADM濃度。

2.4 CCK-8檢測(cè)生脈飲對(duì)ADM損傷H9c2細(xì)胞保護(hù)作用

細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組、ADM組及ADM +生脈飲各劑量組，24 h細(xì)胞貼壁后，根據(jù)分組情況加入ADM和不同濃度生脈飲，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入CCK-8，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)，方法同前。

2.5 試劑盒檢測(cè)損傷后H9c2細(xì)胞內(nèi)SOD,MDA變化

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 方法同前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，孵育24 h后根據(jù)分組情況加入1 μmol/L ADM和不同濃度生脈飲，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

2.5.2 細(xì)胞裂解及SOD、MDA檢測(cè) 造模結(jié)束后將各培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞消化離心后，PBS洗1遍離心后棄上清，每組加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解20 min，離心后取上清測(cè)定蛋白濃度。按照文獻(xiàn)及SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)采用WST-1法進(jìn)行后續(xù)操作，酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)各組SOD活性[5]。應(yīng)用TBA法按照MDA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行后續(xù)操作，酶標(biāo)儀532 nm檢測(cè)各組MDA含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 生脈飲對(duì)心肌H9c2細(xì)胞增殖的影響

圖1示，生脈飲(0.39～1600 μg/mL)對(duì)H9c2細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的毒性作用；生脈飲(25、200、1600 μg/mL)與H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明生脈飲毒性低，在一定劑量范圍內(nèi)作用時(shí)間延長(zhǎng)且能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。

注：A.生脈飲作用H9c2細(xì)胞24 h;B.生脈飲作用H9c2細(xì)胞48 h;C.生脈飲作用H9c2細(xì)胞72 h；與對(duì)照組比較：*P<0.05圖1 生脈飲(0.39～1600 μg/mL)對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響

3.2 ADM損傷心肌H9c2細(xì)胞濃度篩選

圖2示，ADM(1.5625～100 μmol/L)作用H9c2細(xì)胞24 h、48 h、72 h均能夠明顯抑制細(xì)胞增殖。作用72 h時(shí)隨著ADM劑量增加，細(xì)胞存活率逐漸降低并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。

注：A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h;與對(duì)照組比較：**P<0.01；阿霉素(adriamycin,ADM)圖2 ADM(1.5625～100 μmol/L)對(duì)H9c2細(xì)胞的毒性作用

3.3 生脈飲對(duì)ADM損傷H9c2細(xì)胞的影響

根據(jù)3.2結(jié)果，以ADM 1 μmol/L作為H9c2損傷模型，圖3A示，ADM (1 μmol/L)作用H9c2細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；生脈飲400 μg/mL組細(xì)胞存活率高于A(yíng)DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著ADM作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率降低，作用48 h、72 h，ADM組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而生脈飲各劑量組與ADM組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B,C)，表明生脈飲400 μg/mL對(duì)ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h有一定的保護(hù)作用，隨著ADM作用時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞損傷加重，生脈飲不能改善ADM對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

注：A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與ADM組比較#P<0.05;阿霉素(adriamycin,ADM)圖3 生脈飲對(duì)ADM(1μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞的影響

3.4 生脈飲對(duì)ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷SOD的影響

圖4A示，ADM(1 μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞24 h，各組組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4B示，ADM(1 μmol/L )損傷48 h，生脈飲100、200 μg/mL組細(xì)胞內(nèi)SOD活力高于A(yíng)DM組(P<0.05)；圖4C示，ADM(1 μmol/L )損傷72 h，ADM組細(xì)胞內(nèi)SOD活力較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；與ADM組比較，生脈飲50、200 μg/mL組細(xì)胞內(nèi)SOD活力增加(P<0.01)。以上結(jié)果表明，ADM能夠降低細(xì)胞內(nèi)SOD活力，生脈飲保護(hù)心肌細(xì)胞作用可能與增加SOD活力相關(guān)。

注：A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h；B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h；C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與ADM組比較：#P<0.05,##P<0.01;阿霉素(adriamycin,ADM),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)圖4 生脈飲對(duì)ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷SOD的影響

3.5 生脈飲對(duì)ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷MDA的影響

圖5示，ADM(1 μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞24 h、48 h、72 h，ADM組MDA含量較對(duì)照組均顯著升高(P<0.01)，生脈飲各劑量組MDA含量較ADM組均顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果提示，ADM能夠增加胞內(nèi)MAD含量，生脈飲能夠降低ADM損傷引起的MDA含量增加。

注：A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h；B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h；C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與ADM組比較：##P<0.01;阿霉素(adriamycin,ADM),丙二醛(malondialdehyde，MDA)圖5 生脈飲對(duì)ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷MDA的影響

4 討論

ADM是腫瘤化療方案中最常應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一，但其濃度依賴(lài)性的心臟毒性呈現(xiàn)進(jìn)展性和不可逆性，是臨床應(yīng)用前必須考慮的因素。目前，右丙亞胺是唯一批準(zhǔn)用于臨床預(yù)防ADM致心臟毒性的藥物，因價(jià)格較高應(yīng)用受到限制。中醫(yī)藥在預(yù)防腫瘤發(fā)生、抗耐藥、防止復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，從中醫(yī)藥中尋找降低ADM心肌毒性的輔助藥物一直受到廣大科研工作者的關(guān)注，是腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。生脈飲由紅參、麥冬、五味子組成，三藥合用一補(bǔ)一清一斂，共同發(fā)揮益氣生津、斂陰止汗的作用，是治療氣陰兩虛的常用方劑。生脈注射液聯(lián)合5氟尿嘧啶能夠提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，增加化療藥物的抗腫瘤作用[6]。加味生脈飲能夠改善HER-2陽(yáng)性乳腺癌術(shù)后患者赫賽汀靶向治療的臨床癥狀，抑制左心射血分?jǐn)?shù)下降，保護(hù)心肌，提高患者對(duì)赫賽汀所致心臟毒性的耐受力，預(yù)防心臟毒性事件發(fā)生[7]。謝有鑫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，左心射血分?jǐn)?shù)降低性心力衰竭采用生脈注射液和丹參川芎嗪注射液聯(lián)合治療，能明顯改善患者心臟功能，降低腦尿鈉肽和紅細(xì)胞分布寬度水平。生脈注射液聯(lián)合米力農(nóng)注射液，可顯著改善慢性心力衰竭患者的心腎功能，提高心功能分級(jí)[9]。另有報(bào)道，ADM可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)過(guò)度累積，促凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X(B-cell lymphoma-2-Associated X,Bax)表達(dá)量顯著上升，抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)顯著下降，心肌凋亡指數(shù)顯著升高，心肌病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致心功能顯著下降。生脈飲可部分逆轉(zhuǎn)ADM引起的上述變化，對(duì)ADM引起的心肌損傷具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制在于降低ADM誘導(dǎo)的心肌過(guò)度氧化和凋亡[10]。

基于此，本課題以心肌H9c2細(xì)胞為研究對(duì)象，建立ADM損傷心肌細(xì)胞模型，體外觀(guān)察生脈飲對(duì)ADM致H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，生脈飲(0.39～1600 μg/mL)對(duì)H9c2細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的毒性作用；一定的劑量生脈飲(25，200，1600 μg/mL)作用一定時(shí)間(72 h)，能夠促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖，說(shuō)明生脈飲自身對(duì)心肌H9c2細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴(lài)性的促增殖作用。ADM毒性強(qiáng)，1.5625～100 μmol/L ADM作用H9c2細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的毒性，并存在時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。王皓等[11]報(bào)道，與對(duì)照組比較ADM組心肌細(xì)胞活力減弱，本研究與此報(bào)道一致。孫彬栩等[12]報(bào)道新加生脈飲能改善心肌細(xì)胞凋亡大鼠心功能情況，抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，生脈飲400 μg/mL對(duì)ADM(1 μmol/L)損傷H9c2細(xì)胞24 h有一定的保護(hù)作用。隨著ADM作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞損傷加重，生脈飲不能改善ADM對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。ADM心臟毒性的特點(diǎn)在于線(xiàn)粒體氧化磷酸化導(dǎo)致的劑量依存性下降，ADM和鐵相互作用產(chǎn)生的活性氧可以破壞心肌，造成肌原纖維的損失和細(xì)胞質(zhì)的液泡化，從而限制了其在臨床中的應(yīng)用。此外，ADM可引起心肌腎素、血管緊張素Ⅱ、醛固酮以及ROS 生成增高，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，纖維化以及心功能減退[13]。由此，本研究探討了生脈飲對(duì)ADM的損傷作用是否與氧化損傷有關(guān)，以SOD、MDA變化作為氧化損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果顯示生脈飲對(duì)ADM損傷的保護(hù)作用與增加SOD活力、降低MDA含量相關(guān)。

綜上，ADM損傷H9c2心肌模型制備簡(jiǎn)單快捷、條件可控、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，可推廣用于心肌保護(hù)藥物的體外篩選。生脈飲對(duì)心肌細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，生脈飲對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，與增加SOD活力、降低MDA含量相關(guān)，其損傷作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。