張湑澤 付林 鄒小艷 都玉蓉

(1 青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，國(guó)家民委青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810007)(2 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091)(3 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410219)(4 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810008)(5 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

低氧性肺血管收縮(Hypoxia pulmonary vasoconstriction,HPV)反應(yīng)是指在高海拔或常壓低氧條件刺激下，哺乳動(dòng)物肺動(dòng)脈血管阻力增強(qiáng)，肺動(dòng)脈壓升高的生理現(xiàn)象(Voelkelet al.,2013)。長(zhǎng)期低氧可使平原動(dòng)物血管形態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為肺小動(dòng)脈中層肥厚，無(wú)肌型肺小動(dòng)脈出現(xiàn)平滑肌層，血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓。低氧性肺血管收縮反應(yīng)鈍化(Blunted hypoxic pulmonary vasoconstriction,bHPV) 是在長(zhǎng)期缺氧環(huán)境下，哺乳動(dòng)物肺小動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)明顯鈍化，使其能適應(yīng)低氧環(huán)境的生理現(xiàn)象。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae) 屬兔形目(Lagomorpha) 鼠兔科(Ochotonidae) 鼠兔屬，是一種小型非冬眠植食性哺乳動(dòng)物，主要分布于青藏高原及其邊緣地帶，棲息在海拔3 000～ 5 000 m的高寒草甸和灌叢(馮祚建和鄭昌琳，1985)。高原鼠兔通過(guò)降低血液血紅蛋白含量，增強(qiáng)氧利用率，肺血管收縮反應(yīng)鈍化等生理反應(yīng)適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境(Geet al.,1998;Sheafor,2003；王曉君等，2008)。研究發(fā)現(xiàn)高原鼠兔具有低氧脅迫下bHPV、低氧性肺血管重構(gòu)發(fā)生等典型生理和組織形態(tài)特征(Zhaoet al.2004;Liet al.,2009)，與平原動(dòng)物在低氧暴露時(shí)發(fā)生HPV 或肺動(dòng)脈高壓明顯不同。因此，該動(dòng)物被認(rèn)為是研究高海拔低氧適應(yīng)的最佳動(dòng)物模型(杜繼曾和李慶芬，1982；吳雁和杜繼曾，2001)。

間隙連接(Gap Junction,GJ) 廣泛存在于動(dòng)物組織中，是相鄰細(xì)胞間直接的細(xì)胞通訊方式(Kumar and Gilula,1996)，在動(dòng)脈血管各細(xì)胞層都有分布，參與調(diào)解血管收縮和舒張，是小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換的通道(Hervé and Derangeon,2013)。間隙連接蛋白40 (Connexin40,Cx40) 是血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的連接蛋白(Gabriels and Paul,1998;Severset al.,2001;Leybaertet al.,2017)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與低氧性肺血管收縮反應(yīng)，在動(dòng)脈血管發(fā)育、內(nèi)皮依賴型血管舒張傳導(dǎo)、血管壁和心肌細(xì)胞電偶聯(lián)等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Bruzzoneet al.,1993;Witet al.,2000;Simonet al.,2004;W?lfleet al.,2007)。慢性缺氧誘導(dǎo)小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞Cx40蛋白表達(dá)水平降低，使內(nèi)皮依賴型肺血管舒張導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓(翟鵬和尹俊，2016;Siet al.,2020)。鑒于Cx40 在模式動(dòng)物血管發(fā)育調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用及高原鼠兔對(duì)高原低氧的特殊適應(yīng)機(jī)制，我們推測(cè)Cx40 在高原鼠兔低氧適應(yīng)中具有重要作用。探明Cx40 表達(dá)特征對(duì)進(jìn)一步理解Cx40 在高原鼠兔bHPV 反應(yīng)中的作用機(jī)制具有重要價(jià)值。本研究擬對(duì)低氧暴露前后高原鼠兔肺組織中Cx40 表達(dá)位點(diǎn)進(jìn)行定位，檢測(cè)Cx40 表達(dá)量，分析其在高原鼠兔低氧適應(yīng)中的作用。對(duì)Cx40 表達(dá)模式的解析可為高原鼠兔肺組織低氧相關(guān)基因表達(dá)分析提供參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 高原鼠兔樣品采集及處理

2017年6月，在青海海北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站(北緯37°36′07.93″，東經(jīng)101°18′09.03″，海拔3 217 m) 附近，捕捉成年健康高原鼠兔20 只，體重均為100～ 150 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和低氧處理組，每組各6 只，雌雄各半。高原鼠兔對(duì)照組在海北站動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(海拔3 200 m)飼養(yǎng)4周，低氧組在低壓氧艙中，模擬海拔5 000 m，處理4 周。SD 大鼠購(gòu)于陜西省西安市，共20 只，帶回西寧后于SPF 潔凈室靜養(yǎng)4 周，選體重250～300 g 個(gè)體隨機(jī)分為對(duì)照組和低氧處理組，每組各6 只，雌雄各半。SD 大鼠對(duì)照組在中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(海拔2 200 m)繼續(xù)飼養(yǎng)4 周，低氧組在模擬海拔5 000 m 低壓氧艙中處理4 周。低氧處理實(shí)驗(yàn)在青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心的低壓氧艙中進(jìn)行(模擬海拔5 000 m，空氣氧含量為12.95%)。完成處理后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用2.5%戊巴比妥鈉以0.2 mL/100 g 體重進(jìn)行輕微麻醉，測(cè)定生理指標(biāo)后斷頸處死。取高原鼠兔和SD 大鼠部分肺組織，冷凍于液氮，置-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；部分肺組織用4%多聚甲醛固定備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 高原鼠兔Cx40基因mRNA定量分析

提取低氧處理前后高原鼠兔肺組織RNA，根據(jù)高原鼠兔Cx40基因序列(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，基迪奧生物，廣州)，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)Cx40基因引物序列，以GAPDH為內(nèi)參，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。GAPDH引物序列為 F：TCACCACCATGGAGAAGGC；R：GCCAAGCAGTTGGTGGTGCA，擴(kuò)增長(zhǎng)度為169 bp。Cx40引物序列為F：ATCGGCAAGGTCTGGCTCAC；R：CGGCGTGGAGACGAAGATG，擴(kuò)增長(zhǎng)度為204 bp。qRT-PCR測(cè)定低氧處理前后高原鼠兔Cx40基因mRNA表達(dá)量。

1.3 高原鼠兔Cx40蛋白定量分析及免疫組化

對(duì)低氧處理前后高原鼠兔和SD 大鼠肺組織進(jìn)行石蠟切片，免疫組化染色，Western blotting 分析蛋白表達(dá)。肺組織在4℃用4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將包埋樣本切成4.5 μm厚的切片。切片用Cx40(GJα5)抗體(3%牛血清白蛋白稀釋1∶100;BA1593-1) 孵育，4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)(HRP)-山羊抗兔二抗(1∶500;RS 0002)在室溫孵育2 h，進(jìn)行免疫組化染色，用徠卡DMR 相機(jī)進(jìn)行10 × 和40 ×拍照。

使用Bradford 蛋白測(cè)定試劑盒(碧云天生物，北京)測(cè)定肺總蛋白濃度。用15%SDS PAGE 凝膠電泳分離40 μg 的肺組織總蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，在Tris-Tween-20 生理鹽水緩沖液中用3% BSA 封閉過(guò)夜，用Cx40 (GJα5)抗體孵育PVDF 膜(用5% 的脫脂奶粉稀釋1∶500;BA1593-1)，4℃過(guò)夜，再用HRP-山羊抗兔二抗(1∶500)和β-actin 單克隆抗體(1∶500;RLM 3028) 孵育，用HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體(1∶500 雜交)，使用ECL 試劑盒(Beyotime,China) 開(kāi)展底物發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)免疫反應(yīng)信號(hào)，使用Bio-Rad Chemi-DocTM MP成像系統(tǒng)檢測(cè)PVDF膜。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度測(cè)定。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT計(jì)算Cx40相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。用ImageJ 軟件測(cè)定Cx40 和β-Actin 條帶灰度值。以Cx40 蛋白條帶的灰度值與β-Actin 蛋白的灰度值的比值為標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。以上所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0 軟件處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。用Graphpad 8 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)作圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 高原鼠兔和SD 大鼠肺組織低氧后Cx40 蛋白的免疫組化分析

低氧處理后，高原鼠兔肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯變化，肺泡呈空囊泡狀，平均肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)無(wú)顯著性變化，SD 大鼠平均肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)呈顯著增高。對(duì)高原鼠兔及SD 大鼠肺組織切片進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Cx40 蛋白定位于肺組織血管和肺支氣管。低氧處理后，高原鼠兔肺血管Cx40 蛋白減少，肺支氣管Cx40蛋白無(wú)明顯變化；SD 大鼠肺血管和支氣管Cx40蛋白在低氧處理前后均無(wú)明顯變化(圖1)。

圖1 低氧處理前后高原鼠兔和SD大鼠肺組織Cx40蛋白的免疫組化定位.A～B：SD大鼠肺組織切片；C～D：高原鼠兔肺組織切片；E～F：SD大鼠低氧處理后肺組織切片；G～H：高原鼠兔低氧處理后肺組織切片.圖中紅色箭頭指向血管，藍(lán)色箭頭指向支氣管Fig.1 Cx 40 localization in the lung tissues of plateau pika and SD Rat between hypoxia group and control group.A-B: refers lung tissue sections of SD rats;C -D: refers lung tissue sections of plateau pika;E -F: refers lung tissue sections of SD rats treated with hypoxia;G -H: refers lung tissue sections of plateau pika treated with hypoxia.The red arrow point to vascular,the blue arrow points to the bronchus.The red arrow point to vascular,the blue arrow points to the bronchus

2.2 低氧處理后高原鼠兔肺組織Cx40 基因mRNA表達(dá)量

qPCR 數(shù)據(jù)顯示，高原鼠兔肺組織Cx40基因在低氧處理前后均有表達(dá)，低氧處理后，高原鼠兔Cx40基因mRNA 表達(dá)量呈顯著升高(P=0.013)(圖2)。

圖2 高原鼠兔低氧處理前后Cx40 基因mRNA 表達(dá)量(n=6).mRNA定量以GAPDH為內(nèi)參基因，結(jié)果以mean±SE表示，*表示顯著差異(P ＜0.05)Fig.2 Cx40 mRNA expression level in plateau pikas treated with hypoxia (n=6). GAPDH was used as the reference gene for mRNA quantification,and the result was expressed by mean ± SE.* represents significant difference(P ＜0.05)

2.3 Cx40蛋白表達(dá)水平分析

Cx40蛋白水平分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高原鼠兔低氧處理組Cx40 蛋白水平顯著降低(P=0.008)；低氧處理前后SD 大鼠Cx40蛋白水平無(wú)顯著變化(P=0.984 3)(圖3)。

圖3 高原鼠兔和SD 大鼠在低氧處理前后Cx40 蛋白水平的變化(n=3).蛋白定量以β-actin 為內(nèi)參，結(jié)果以mean±SE 表示.**表示極顯著差異(P ＜0.01)，ns表示無(wú)顯著差異Fig.3 Changes of Cx40 protein levels in plateau pika and SD rat under hypoxia treatment (n=3).β-actin was used as internal reference for protein quantification,and the results were expressed as mean ±SE;** represented extremely significant difference (P ＜0.01),while ns represented no significant difference

3 討論

高原鼠兔在長(zhǎng)期適應(yīng)低氧過(guò)程中，部分形態(tài)特征和生理性狀明顯特化，如較恒定的肺動(dòng)脈壓、無(wú)右心室肥大、更低的缺氧血管收縮反應(yīng)等(Geet al.,1998；王曉君等，2008)。高原鼠兔具有明顯的bHPV 反應(yīng)，其肺小動(dòng)脈壁薄，維持較薄的中膜平滑肌層以降低肺血管阻力(王曉勤等，2001；陳秋生等，2006；李雙等，2020)。而大鼠等平原動(dòng)物在長(zhǎng)期低氧環(huán)境中會(huì)形成以肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)，肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增生和中層平滑肌增厚為主的低氧性肺動(dòng)脈高壓(陳秋紅，2001；馬蘭等，2007；張晶晶，2018；王睿等，2021)。研究表明，低氧處理后，高原鼠兔平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心指數(shù)(RV/LV)無(wú)明顯變化，SD 大鼠平均肺動(dòng)脈壓明顯升高，右心指數(shù)明顯增大(付林，2018;Zhanget al.,2022)。肺動(dòng)脈壓基本穩(wěn)定可避免高原鼠兔因右心室負(fù)荷加重，導(dǎo)致右心室肥厚甚至右心功能衰竭。本研究中，肺組織免疫組化結(jié)果表明，高原鼠兔和SD大鼠Cx40蛋白定位于肺支氣管和肺血管壁，低氧處理后，高原鼠兔肺支氣管Cx40蛋白無(wú)明顯變化，肺血管Cx40蛋白明顯減少，SD大鼠肺血管和肺支氣管Cx40蛋白均無(wú)明顯變化；qPCR結(jié)果顯示，高原鼠兔Cx40基因mRNA 表達(dá)量呈顯著上升，與高原鼠兔肺組織RNA-Seq分析結(jié)果一致(Zhanget al.,2022)；Western bloting結(jié)果顯示，高原鼠兔肺組織Cx40蛋白在低氧處理后表達(dá)量下降，SD大鼠肺組織Cx40蛋白未表現(xiàn)出明顯的表達(dá)量變化。以上結(jié)果表明，低氧處理后，高原鼠兔和SD大鼠Cx40蛋白表達(dá)水平不同。高原鼠兔通過(guò)肺血管Cx40 蛋白下調(diào)介導(dǎo)低氧性肺血管收縮反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制血管收縮信號(hào)，減弱低氧性肺血管的收縮，使高原鼠兔肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)維持相對(duì)穩(wěn)定(Wanget al.,2012；卓泓宇等，2014；潘立君等，2015)。

一氧化氮(NO) 可能是Cx40 蛋白參與低氧性肺血管收縮反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible transcription factors,HIFs)是肺動(dòng)脈高壓調(diào)控的關(guān)鍵因子(Zhaoet al.,2004)，參與肺血管重塑、細(xì)胞增殖和調(diào)控HPV 反應(yīng)(Cowburnet al.,2016)。NO 是由一氧化氮合酶合成，在HIFs 調(diào)控下參與低氧應(yīng)答和低氧性血管重構(gòu)過(guò)程(Grilli,2003;Semenza,2005)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮合酶的表達(dá)，可降低間隙連接的滲透性(Bolanos and Medina,1996)，NO 也可通過(guò)cGMP-PKG 通路引起間隙連接蛋白磷酸化(Lu and Mcmahon,1997;Rudyket al.,2019)，暗示NO 或能調(diào)控間隙連接蛋白功能。NO 是高原鼠兔體內(nèi)最重要的血管舒張因子之一，通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，舒張肺血管(汪濤等，2004)，其含量隨著高原鼠兔所處環(huán)境氧分壓的升高而降低(Xieet al.,2014)。因此，我們推測(cè)NO-Cx40 作用于高原鼠兔肺血管，引起平滑肌細(xì)胞舒張而降低肺小血管阻力，減輕血管收縮程度(Weigert,1996)。本研究中，高原鼠兔在低氧處理后肺組織Cx40 蛋白水平顯著下降，提示高原鼠兔通過(guò)降低NO 含量，降低Cx40 蛋白表達(dá)水平，減弱低氧性肺血管收縮，以適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境。但關(guān)于高原鼠兔NO 含量與低氧性肺血管收縮反應(yīng)調(diào)控的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，NO作用于HPV的靶位點(diǎn)也還待進(jìn)一步證實(shí)。而Cx40基因mRNA 表達(dá)量升高表明高原鼠兔Cx40 在轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程可能受不同通路調(diào)控，通過(guò)磷酸化、甲基化等翻譯后修飾調(diào)節(jié)間隙連接細(xì)胞間通訊(Totlandet al.,2020)，暗示高原鼠兔低氧調(diào)控通路的復(fù)雜性。

綜上所述，高原鼠兔在受到低氧脅迫后，通過(guò)降低Cx40 蛋白的表達(dá)，抑制血管收縮信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)的相對(duì)穩(wěn)定，介導(dǎo)其低氧性肺血管收縮反應(yīng)鈍化。本研究定位了Cx40 在高原鼠兔肺組織中表達(dá)位點(diǎn)，初步驗(yàn)證了低氧處理后Cx40 mRNA 和蛋白表達(dá)趨勢(shì)，為深入研究Cx40 在高原土著動(dòng)物低氧適應(yīng)中的功能提供一定的理論線索。高原鼠兔世代生活在低氧環(huán)境中，其bHPV 的遺傳分子機(jī)制還需進(jìn)一步基因功能驗(yàn)證。后期我們將基于高原鼠兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用shRNA 驗(yàn)證Cx40 在高原鼠兔低氧適應(yīng)過(guò)程中的功能。

致謝：感謝湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭松長(zhǎng)教授對(duì)文章的指導(dǎo)和建議，感謝青海民族大學(xué)馬曉東博士協(xié)助修改論文，感謝青海海北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站提供采樣地。