成若通 陳一博 孟祥瓊 陳家瑞 魏青

(青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧 810016)

遺傳多樣性反映了物種應對環(huán)境變化與進化的潛力，遺傳多樣性越高，對環(huán)境變化的適應能力就越強(沈浩和劉登義，2001)。對于經(jīng)歷過人類獵殺導致種群危機的野生物種，隨著短時間內(nèi)大量個體的消亡，很多潛在的優(yōu)良基因單倍型也會喪失，在后續(xù)種群數(shù)量恢復過程中，這些單倍型并不會隨著種群個體數(shù)量的增加而迅速恢復，即遺傳多樣性的恢復明顯滯后于種群數(shù)量的恢復(Frankhamet al.,2002)。張志和(2006)研究發(fā)現(xiàn)華南虎(Panthera tigris amoyensis)雖仍維持較高的遺傳多樣性，但很多稀有單倍型僅存于一個或兩個個體，極易因攜帶者死亡而丟失，其遺傳多樣性難以維持；朱鹮(Nipponia nippon)作為瀕危物種種群恢復的典型案例，1982年被發(fā)現(xiàn)時僅有7只，現(xiàn)在雖已恢復至7 000 多只，但由于種群奠基者數(shù)量太少，導致現(xiàn)有朱鹮種群近親繁殖系數(shù)高、遺傳多樣性低(Zhanget al.,2004)。因此，種群遺傳多樣性監(jiān)測是物種保護的重要內(nèi)容之一。

藏羚(Pantholops hodgsonii)是青藏高原動物區(qū)系的典型代表，主要分布在以羌塘為中心的高原地區(qū)。20 世紀中期瘋狂的盜獵行為使數(shù)十萬只藏羚喪生，其種群數(shù)量在2003年降到了最低的5萬只左右(Leclercet al.,2015)，現(xiàn)已恢復至約30 萬只(陳建偉和劉璐，2021)。近年來對藏羚線粒體基因和常染色體基因的STR 遺傳標記分析表明藏羚種群仍然具有豐富的遺傳多樣性(Zhanget al.,2013;Duet al.,2016)。然而，對藏羚性染色體的基因多樣性研究目前仍處于空白。已有的研究表明，藏羚種群性別比例明顯偏雌(夏霖和楊奇森，2015)，即雄性藏羚在其生活史中面臨更高的死亡風險，且藏羚的婚配制度為一夫多妻(Blanchardet al.,2004)，Y 染色體遺傳多樣性特征對于全面掌握藏羚種群遺傳特征具有重要意義。Y染色體作為雄性特有的染色體，具有突變率低、遵循父系遺傳、不易受重組影響等特點(Clark,2014;Cortezet al.,2014)，基于Y 染色體的單核苷酸多態(tài)性(Y-SNP)是研究家養(yǎng)動物常用的遺傳標記，已被廣泛應用于人(Keet al.,2001)、普通牛(G?therstr?met al.,2005)、牦牛(馬志杰，2019)、綿羊(王玉濤等，2011)等物種的遺傳多樣性、父系起源、分化和分類等相關研究。然而，針對野生動物Y-SNPs 的相關研究還相對較少。

為探索藏羚的Y染色體遺傳多樣性，更加全面掌握藏羚種群遺傳特征，本研究基于已發(fā)表的?？苿游颵-SNP位點信息，篩選出藏羚特異性Y-SNP位點并進行測序，利用多態(tài)性位點對藏羚Y染色體遺傳多樣性進行分析，為深入了解藏羚種群遺傳多樣性水平、群體遺傳結構及父系起源等提供理論支撐，同時為藏羚種群的保護提供科學參考。

1 研究方法

1.1 樣品采集

2014 年和2021 年在三江源國家公園可可西里卓乃湖區(qū)域(北緯35°27′～ 35°29′，東經(jīng)91°50′～92°03′)共收集意外死亡藏羚肌肉和新生幼仔胎盤組織樣品77 份；2021 年在新疆阿爾金山國家級自然保護區(qū)兔子湖區(qū)域(北緯36°38′～ 36°42′，東經(jīng)87°13′～87°15′)共收集肌肉組織和新生幼仔胎盤組織樣品8份。野外收集樣品后保存于95%乙醇中帶回實驗室，于冰箱中4℃保存。

1.2 實驗方法

藏羚基因組DNA 的提取。參照Strauss (1999)的氯仿異戊醇(24∶1) 法抽提制備藏羚基因組DNA，NanoDrop 核酸檢測儀測定其濃度和純度，無菌水稀釋至80 ng/μL備用。

藏羚樣品性別的鑒定。參考?？苿游镄詣e鑒定通用引物SE47/SE48 (Weikardet al.,2006)，Y1/Y1 (Raoet al.,1995) 對樣品進行性別鑒定，引物由上海生工生物工程有限公司合成。雄性樣品用于后期Y染色體遺傳多樣性分析。

藏羚Y-SNP 位點的篩選和測序。查閱相關文獻并整理已在其他?？苿游颵 染色體上驗證具有多態(tài)性的SNP 位點，選擇SRY15、SRY17、ZFY10、ZFY11、AMELY3、DDX3Y、UTY1、SRYOY1、DBY(Meadowset al.,2004)、UTY19(G?therstr?met al.,2005)、SRY(Meadowset al.,2006)、ZFY1、ZFY2、ZFY3、SRY4、SRY5、SRY6(Nijmanet al.,2008)、ZFY9、ZFY10-2、DDX3Y1、DDX3Y7(Ginjaet al.,2009)、USP9Y、ZFY(Bonfiglioet al.,2012)、SRY18(蔣利，2013)、OFD1Y1、OFD1Y9、SRY3、AMELY1、AMELY2、AMELY4(Liet al.,2014)等30個?？苿游锒鄳B(tài)性Y-SNP位點，由上海生物工程股份有限公司合成引物后，篩選出藏羚Y染色體可用引物。篩選流程為：利用雄性藏羚基因組DNA 對所有引物進行溫度梯度PCR 確定最佳擴增溫度；以雌性樣品DNA 為陰性對照，ddH2O為空白對照，5個雄性藏羚樣品建立混池DNA，對具有單一擴增條帶的引物進行二次篩選；取雄性特異性擴增產(chǎn)物送至測序公司進行基因測序，篩選出多態(tài)性引物后再對所有雄性樣品進行擴增、測序。測序由金唯智生物科技有限公司完成。PCR擴增體系(25 μL)為：gDNA 80 ng，上下游引物各1 μL，2 ×Taq Mix 12.5 μL，ddH2O 補足。PCR 擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，X℃退火30 s(X為退火溫度)，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。測序結果基于SeqMan 軟件進行人工核對，MEGA11 軟件(Tamuraet al.,2011)對序列結果進行比對分析，DnaSP V6 分析單倍型及多態(tài)性信息(Libradoet al.,2009)，利用Arlequin 3.1 計算藏羚青海種群和新疆種群之間基于Y 染色體的遺傳分化指數(shù)(FST)(Excoffieret al.,2005)。

2 結果

2.1 藏羚Y染色體特異性引物篩選

經(jīng)篩選，30 對牛科動物多態(tài)性Y-SNP 位點引物中，有16 對引物在藏羚中具有擴增條帶，其中11 對為藏羚Y 染色體特異性引物(表1)，部分引物擴增條帶電泳檢測結果見圖1。

表1 藏羚Y染色體特異性引物信息表Table 1 Tibetan antelope Y chromosome specific primer information table

圖1 藏羚SRYOY1 位點PCR 擴增條帶.M：Marker；♂：雄性樣品；♀：雌性樣品；CK：空白對照Fig.1 SRYOY1 locus PCR amplification bands of Tibetan antelope.M:Marker;♂:Male samples;♀:Female sample;CK:Control check

2.2 藏羚Y染色體遺傳多樣性分析

使用藏羚雄性特異性引物對混池DNA 進行PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物送至測序公司測序，結果顯示：SRY6、SRYOY1、SRY4、AMELY4、ZFY2、AMELY3、DDX3Y7、DDX3Y、USP9Y、UTY19、ZFY3等11 對引物獲得的有效測序基因長度分別為452 bp、551 bp、791 bp、607 bp、546 bp、801 bp、262 bp、143 bp、423 bp、237 bp、587 bp；11個基因片段中AMELY3和SRYOY1兩個位點具有多態(tài)性。AMELY3在723 堿 基 處 存 在C ＞T 轉(zhuǎn) 換 突 變；SRYOY1在167 堿基處存在G ＞A 轉(zhuǎn)換突變。使用AMELY3及SRYOY1兩對引物對藏羚雄性樣品進行擴增測序，AMELY3測序結果包含2 個單倍型，其中g.723 T 僅在一個樣品中出現(xiàn)，為稀有單倍型，基于AMELY3位點計算得到藏羚Y染色體單倍型多樣性為0.048±0.045，核苷酸多態(tài)性為0.00006±0.00005；SRYOY1共得到51個有效樣品測序結果，包含2個單倍型，其中單倍型H1(g.167 G)占總樣品的68.6%，為優(yōu)勢單倍型，單倍型H2(g.167 A)占總樣品的31.4%；基于SRYOY1位點計算得到藏羚Y 染色體單倍型多樣性(Hd) 為0.439 ± 0.050，核苷酸多樣性(Pi)為0.0008±0.0004(圖2)。

圖2 藏羚多態(tài)性位點測序峰圖.a：SRYOY1(g.167 G ＞A)；b：AMELY3(g.723 C ＞T)Fig.2 Sequencing peak map of polymorphic sites in Tibetan antelope.a:SRYOY1(g.167 G ＞A)；b:AMELY3(g.723 C ＞T)

2.3 藏羚父系起源分析

基于SRYOY1測序結果，采用最大似然法構建雄性藏羚的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，顯示所有雄性樣品聚為兩個分支，推斷藏羚種群可能具有兩個父系起源?；赟RYOY1對雄性藏羚青海種群和新疆種群Y 染色體種群遺傳分化指數(shù)進行計算得出，F(xiàn)ST為0.6846 ± 0.0389，即兩個地區(qū)藏羚雄性種群之間已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的種群分化。

圖3 基于SRYOY1 位點的最大似然法構建雄性藏羚系統(tǒng)發(fā)育樹.QH：青海樣品；XJ：新疆樣品Fig.3 Maximum Likelihood tree of male Tibetan antelopes based on the sequencing of the SRYOY1 loci.QH: Qinghai samples;XJ: Xinjiang sample

3 討論

研究表明，Y染色體遺傳多樣性顯著低于常染色體和線粒體基因(Hellborget al.,2004)。本研究從30對?？苿游颵染色體多態(tài)性引物中篩選出11對藏羚雄性特異性引物，共獲得AMELY3和SRYOY1兩個多態(tài)性位點。藏羚Y 染色體核苷酸多樣性高于綿羊(Pi=0.00009 ± 0.00005) (Meadowset al.,2004)、建昌馬(Pi=0.00038 ± 0.00008) (劉敏，2021)、中國馬(Pi=0.000 4) (張欽，2015)、梅花鹿(Pi=0.000 36) (周永娜等，2018) 等哺乳動物。藏羚Y染色體單倍型多樣性低于建昌馬(Hd=0.767±0.090)(劉敏，2021)、馬鹿(Hd=0.877)(房瑞新，2021)、梅花鹿(Hd=0.696 80)(周永娜等，2018)、家牦牛(Hd=0.6946 ± 0.0143) (馬志杰，2019)、野生馬鹿(Hd=0.865) (房瑞新，2021)、野牦牛(Hd=0.8214 ± 0.1007) (馬志杰，2019) 等哺乳動物。提示藏羚Y 染色體核苷酸多樣性較高，單倍型多樣性偏低?；赟RYOY1位點，將來自青海和新疆的51份樣品分為H1(g.167 G)和H2(g.167 A)兩種單倍型，且兩種單倍型在青海和新疆兩地的樣品中均有出現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹提示現(xiàn)有的藏羚種群可能具有2個父系起源。不同于利用線粒體和常染色體STR 遺傳標記顯示的藏羚青海種群和新疆種群間極弱的遺傳分化(Duet al.,2010)，青海藏羚雄性種群與新疆藏羚雄性種群間已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的遺傳分化。青海和新疆藏羚種群之間基于不同遺傳標記分析得出的遺傳分化程度差異，與雌性藏羚和雄性藏羚不同的遷徙行為有很大的關系。三江源國家公園可可西里園區(qū)的太陽湖—卓乃湖一帶是青海、新疆及西藏雌性藏羚種群共同的重要產(chǎn)羔地(劉務林，2008)，由此在產(chǎn)羔期帶來的混群效應及基因流(Zhanget al.,2013)在一定程度上弱化了不同地理種群間的遺傳差異，再加上線粒體基因為母系遺傳，因此在基于常染色體和線粒體遺傳標記分析藏羚不同地理種群間的遺傳分化時，其分化程度較弱；而雄性藏羚不參與或者不完全參與雌性藏羚的產(chǎn)羔遷徙行為(Schalleret al.,1998,2006)，地理隔離效應顯著，使得兩個地區(qū)基于Y 染色體遺傳標記的雄性藏羚種群遺傳分化顯著。

基于以上認識，本研究在藏羚中發(fā)現(xiàn)2 個YSNP 位點具有多態(tài)性，分別為AMELY3(g.723 C ＞T)和SRYOY1(g.167 G ＞A)，最大似然樹提示藏羚可能有2個父系起源。Y染色體遺傳多樣性分析顯示藏羚具有較低的Y 染色體單倍型多樣性(Hd=0.439 ± 0.050) 和較高的Y 染色體核苷酸多樣性(Pi=0.0008±0.0004)，青海藏羚雄性種群與新疆藏羚雄性種群間已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的遺傳分化，提示藏羚的保護依然任重道遠，跨區(qū)域的物種保護勢在必行，且從另一個層面提示我們今后對野生動物種群遺傳多樣性的評價中需提高對性染色體的關注。