周 健，左原源，趙雨芊，賴清潤(rùn)，鄭惠文，趙 鑫，秦 麗，張興龍，施海晶，劉龍丁，李 恒**

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091)

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）導(dǎo)致的急性呼吸道疾病.SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒家族中β屬的新成員，其由單股正鏈RNA、刺突蛋白（S）、包膜蛋白(E)，膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)及其他輔助蛋白構(gòu)成[1].由于RNA 病毒易突變的特性，隨著疫情的蔓延，世界各地相繼發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SARSCoV-2 突變株，例如Alpha、Beta、Delta、Omicron等[2].目前，疫苗是防控此類傳染病的最佳手段.DNA 疫苗以其制作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等特點(diǎn)[3]在SARS-CoV-2 的疫苗研發(fā)過程中受到了廣泛關(guān)注.

作為組成SARS-CoV-2 的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一的N 蛋白由3 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：N 末端結(jié)構(gòu)域（NTD）；C 末端結(jié)構(gòu)域（CTD）；RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CLR）[4].N 蛋白具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保守性強(qiáng)等特點(diǎn)，參與了病毒感染過程中的轉(zhuǎn)錄及編碼蛋白質(zhì)過程，在整個(gè)病毒感染過程中呈現(xiàn)高度免疫原性，是抗體結(jié)合的重要目標(biāo)，同時(shí)包含T 細(xì)胞表位[5-7]，使其可能成為疫苗研發(fā)的潛在靶點(diǎn)之一.

脂質(zhì)體（LNP）具有細(xì)胞樣膜結(jié)構(gòu)、生物相容性高、免疫原性低、保護(hù)藥物或活性基團(tuán)、延長(zhǎng)藥物半衰期、降低毒性、提高效率等優(yōu)點(diǎn)，并且通過基于經(jīng)典脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)修飾和表面修飾，可以產(chǎn)生具有特定生物學(xué)效應(yīng)的新型脂質(zhì)體，擴(kuò)展了脂質(zhì)體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[8-10].1965 年，Bangham 等[11]首次發(fā)現(xiàn)磷脂分子可以自發(fā)地在水中形成閉合的雙層囊泡.大小范圍為5～200 nm 之間的脂質(zhì)體可以利用囊泡的親和力將親水性或親脂性藥物封裝在水相或雙層膜相中，由此將脂質(zhì)體引入藥物輸送系統(tǒng)領(lǐng)域[12]，并且后期技術(shù)的進(jìn)步提高了脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)的包封率和藥物的穩(wěn)定性[13].隨著SARS-CoV-2 在全球范圍內(nèi)蔓延，脂質(zhì)體在疫苗開發(fā)領(lǐng)域獲得了極大地關(guān)注，尤其是在mRNA 疫苗研發(fā)領(lǐng)域，有多款針對(duì)SARS-CoV-2 的mRNA-LNP疫苗在進(jìn)行臨床試驗(yàn)并成功上市.相對(duì)于“裸mRNA”，用脂質(zhì)體包被的mRNA 疫苗表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫原性[14].

DNA 疫苗是伴隨著基因療法發(fā)展而出現(xiàn)的新型疫苗，通過將含有編碼目的抗原蛋白基因序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞中，借助細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制表達(dá)相應(yīng)抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)此抗原蛋白的免疫應(yīng)答，最終達(dá)到免疫的目的.作為第三代疫苗中的代表，DNA 疫苗相較于傳統(tǒng)的滅活/減毒疫苗以及蛋白質(zhì)/肽類疫苗具有更穩(wěn)定、更經(jīng)濟(jì)、更容易制備、處理更安全的特點(diǎn)[3].基于這些優(yōu)點(diǎn)以及其獨(dú)特的理化性質(zhì)和免疫效應(yīng)，DNA疫苗受到了生物醫(yī)學(xué)界的廣泛重視，被應(yīng)用于包括癌癥治療[15]、過敏[16]、自身免疫疾病[17]以及傳染病治療[18]等方面.盡管DNA 疫苗具有諸多優(yōu)勢(shì)，但是其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答效率低下的問題一直阻礙了DNA 疫苗的臨床應(yīng)用[19-20].

我們使用脂質(zhì)體包被SARS-CoV-2 的N 蛋白編碼基因，經(jīng)過脂質(zhì)體的純化、電鏡觀察、并進(jìn)行定量將其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T，發(fā)現(xiàn)LNP-SARSCoV-2 N 能夠?qū)崿F(xiàn)高效轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T.本研究為脂質(zhì)體包被的新型冠狀病毒DNA 疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑293T 細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室提供；pcDNA3.1 真核表達(dá)載體為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室保持和制備；大腸桿菌DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞來自TaKaRa 公司；PCR 引物由北京擎科生物有限公司合成；兔來源的SARSCoV-2 N 蛋白抗體來自北京義翹神州科技股份有限公司；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 來自abcam 公司；質(zhì)粒大提試劑盒來自TIANGEN 公司；PrimeScript? IV 1st strand cDNA Synthesis Mix試 劑 盒 及Pyrobest? DNA Polymerase 試劑來自TaKaRa 公司；FUGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑盒來自Promega 公司.

1.2 儀器微流控系統(tǒng)（Precision Nanosystems，NANOASSEMBLR?IGNITE?）；凝膠成像系統(tǒng)（Biorad，GEL DOC XR+）；定量梯度PCR 儀（Bio-rad，C1000）；紫外分光光度計(jì)（ThermoFisher，Nanodrop 2000C）；超速冷凍離心機(jī)（Hitachi，CP70ME）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 N 蛋白編碼基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上編號(hào)為NC-045512.2 的SARS-CoV-2 毒株序列和真核表達(dá)載體pcDNA3.1 的序列，利用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增N 蛋白全長(zhǎng)序列的PCR 引物.引物序列如下，F(xiàn)orward primer：TAGCG TTTAAACTTAAGCTTGACATGGGCATGTCTGA TAATGGA；Reverse primer：CCACACTGGACTAG TGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGGCC TGAGTTGAGTCAGC.上游引物中的GACATG GGC 為引入的Kozak 序列，AAGCTT 為引入的HindⅢ酶切位點(diǎn)，TAGCGTTTAAACTT 為真核表達(dá)載體pcDNA3.1 上HindⅢ酶切位點(diǎn)上游的同源區(qū)段.下游引物中終止密碼子TTA 與密碼子GGC之間的序列：ATGGTGATGGTGATGATG 為引入的6X His 蛋白標(biāo)簽的編碼序列用于后續(xù)的蛋白純化，GGATCC 為引入的BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，而CCACACTGGACTAGT 為真核表達(dá)載體pcDNA3.1上的BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)下游同源區(qū)段.

取10 μL RNA 模板，參照PrimeScript? IV 1st strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收.

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 對(duì)真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）用HindⅢ和BamH Ⅰ雙酶切后，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收.利用NEB 公司的同源重組酶，按PCR 產(chǎn)物與質(zhì)粒載體物質(zhì)的量比2∶1，50 ℃ 30 min 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的AMP 抗生素的LB 固態(tài)培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜.獲得重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-N-His，利用擴(kuò)增N 蛋白全長(zhǎng)的PCR 引物經(jīng)菌落PCR 鑒定正確后，進(jìn)行測(cè)序鑒定.

1.3.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定 重組質(zhì)粒鑒定成功后，對(duì)含重組質(zhì)粒的DH-5α 大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，挑選單菌落于含質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的AMP 抗生素的LB 液態(tài)培養(yǎng)基上，37 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)過夜.利用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染.參照FUGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔3 μg 質(zhì)粒和9 μL FUGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑混合.轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行Westernblot 以及銀染?蛋白質(zhì)譜分析.Western-blot 實(shí)驗(yàn)操作如下：蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜PVDF 后，用兔來源的SARS-CoV-2 N 蛋白抗體按體積比1∶1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜；洗滌后再按體積比1∶5 000 稀釋的羊抗兔IgG-HRP 于37 ℃孵育1 h；洗滌后進(jìn)行曝光觀察結(jié)果.銀染實(shí)驗(yàn)操作如下：提取的細(xì)胞蛋白經(jīng)鎳柱親和層析，梯度洗脫后收集純化產(chǎn)物并利用30 ku 超濾管富集.產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分離后，按照碧云天快速銀染試劑盒說明書對(duì)SDS-PAGE 膠進(jìn)行處理，產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析.

1.3.4 脂質(zhì)體包被和鑒定 脂質(zhì)體由陽離子脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、膽固醇構(gòu)成，包裹核酸形成完整的核酸疫苗[21].我們采用無水乙醇溶解后的陽離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇、PEG2000（物質(zhì)的量比40∶10∶47.5∶2.5）來制備脂質(zhì)體.將質(zhì)粒溶解于pH=5的PBS 中，利用微流控技術(shù)將脂質(zhì)體與質(zhì)粒按體積比1∶1 的比例以12 mL/min 進(jìn)行脂質(zhì)體配制[22].利用蔗糖密度梯度離心法分離純化脂質(zhì)體，通過核酸電泳確定脂質(zhì)體中是否含有質(zhì)粒，再通過TEM電鏡觀察形態(tài)確定是否形成脂質(zhì)體納米顆粒.

1.3.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了PBS、空脂質(zhì)體、DNA-LNP、FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組.將DNA-LNP 和1.5% Triton 按體積比1∶1 混合，裂解脂質(zhì)體，然后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定脂質(zhì)體裂解后的DNA 質(zhì)量濃度，根據(jù)此質(zhì)量濃度按6 孔板每孔3 μg DNA，用opti-MEM 培養(yǎng)基定容到200 μL 進(jìn)行轉(zhuǎn)染.PBS 以及空脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)組按每孔200 μL 加入293T 細(xì)胞中，F(xiàn)uGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑實(shí)驗(yàn)組以每孔3 μg DNA 加入293T 細(xì)胞中.另外，還進(jìn)行了梯度質(zhì)量轉(zhuǎn)染，使用含0.1，0.3，1，3，10 μg DNA 的脂質(zhì)體納米顆粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞.培養(yǎng)30 h后提取蛋白進(jìn)行Western-blot 檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定SARS-CoV-2 N 編碼基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后通過PCR 擴(kuò)增，經(jīng)電泳顯示成功擴(kuò)增出目的大小的片段，約為1 328 bp（圖1（a））.經(jīng)膠回收后與pcDNA3.1 載體連接，轉(zhuǎn)入DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR，獲得目的大小片段，并進(jìn)行測(cè)序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致（圖1（b））.

圖1 SARS-CoV-2 N 編碼基因PCR 擴(kuò)增及pcDNA3.1(+)-N 載體構(gòu)建Fig.1 PCR amplification of SARS-CoV-2 N coding gene and construction of pcDNA3.1(+)-N

2.2 重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定將pcDNA3.1-N 轉(zhuǎn)染293T 后進(jìn)行Western-blot 檢測(cè)，并經(jīng)鎳柱純化后銀染進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，Western-blot 雜交得到約46 ku 的特異性條帶，為預(yù)期大小的蛋白（圖2（a））.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析表明該條帶蛋白為正確表達(dá)的SARS-CoV-2 N 蛋白（圖2（b）、（c））.

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-N 在293T 細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot 及質(zhì)譜檢測(cè)Fig.2 Western blot results of the expression product of recombinant plasmid pcDNA3.1-N in 293T cells and protein mass spectrometry

2.3 SARS-CoV-2 NDNA-LNP 包被鑒定 配制好的LNP-DNA 經(jīng)蔗糖密度梯度離心分離富集后，進(jìn)行核酸電泳，超離前3 層都有核酸條帶（圖3（a））.TEM 觀察經(jīng)蔗糖密度梯度離心后的SARS-CoV-2 N DNA-LNP，在超離第2 層發(fā)現(xiàn)大小在50～100 nm的脂質(zhì)體納米顆粒（圖3（b）），表明脂質(zhì)體成功包被N 基因質(zhì)粒.Triton 裂解后檢測(cè)脂質(zhì)體中DNA質(zhì)量濃度為530 ng/μL，將LNP-N 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，LNP-N、FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑組都可以在約46 ku 附近看到明顯條帶（圖4（a））.梯度質(zhì)量轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞表明，含0.3 μg DNA 的脂質(zhì)體能夠看到明顯的轉(zhuǎn)染產(chǎn)物，在六孔板中每孔含1 μg DNA的脂質(zhì)體即可實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染（圖4（b）），說明脂質(zhì)體包被的N 基因質(zhì)粒具有較高的轉(zhuǎn)染效率.

圖3 密度梯度離心后電泳結(jié)果及透射電鏡觀察結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results after density gradient centrifugation and SARS-CoV-2 N DNA-LNP in TEM observation

圖4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染效果對(duì)比Fig.4 Transfection efficiency by LNP and FuGENE? HD

3 討論和結(jié)論

從2019 年底至今，新型冠狀病毒一直在全球范圍內(nèi)蔓延.根據(jù)世界衛(wèi)生組織官網(wǎng)上提供的數(shù)據(jù)，截止到2021 年12 月28 號(hào)，新型冠狀病毒已造成全球范圍內(nèi)將近2.79 億人感染，其中超過500 萬人死亡[23].目前國(guó)內(nèi)以滅活疫苗為主，起到了較好的保護(hù)效率，且不良反應(yīng)也較低.然而，SARS-CoV-2 易發(fā)生突變，導(dǎo)致疫苗的免疫效果下降，疫苗可能需要根據(jù)突變株更新?lián)Q代[24].體液免疫和細(xì)胞免疫被認(rèn)為在預(yù)防病毒感染過程中起到重要作用[25].DNA 疫苗既能產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，也能引起體液免疫應(yīng)答，并且通過基因工程技術(shù)可使DNA疫苗質(zhì)粒上結(jié)合多個(gè)抗原基因，可以實(shí)現(xiàn)通用疫苗的研發(fā).當(dāng)病毒發(fā)生突變時(shí)，可直接對(duì)DNA 疫苗質(zhì)粒上的抗原種類基因進(jìn)行替換以適應(yīng)突變型疫苗研發(fā)[26-27].并且DNA 疫苗生物安全性高，容易大量制備，成本低廉，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸.

在脂質(zhì)體遞送抗原應(yīng)用方面，目前具有新型脂質(zhì)分子或偶聯(lián)物的新型脂質(zhì)體和新型制劑為安全有效地治療多種疾病開辟了可能性.新型脂質(zhì)體可以延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間或?qū)ｉT將藥物輸送到治療靶點(diǎn)，且在體內(nèi)沒有表現(xiàn)出可檢測(cè)的毒性[28-29].基于此優(yōu)點(diǎn)，脂質(zhì)體在疫苗開發(fā)領(lǐng)域也獲得了極大的關(guān)注，強(qiáng)化了疫苗的免疫保護(hù)效果[30-31].

我們將SARS-CoV-2 N 的編碼序列逆轉(zhuǎn)錄成DNA 克隆入pcDNA3.1 載體中，含有可以促進(jìn)下游基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效表達(dá)的CMV 啟動(dòng)子.將此重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體包被后可以形成大小在50～100 nm 的脂質(zhì)體納米顆粒.自從1965 年Bangham 等[11]第1 次嘗試將脂質(zhì)體引入到藥物輸送系統(tǒng)領(lǐng)域以來，脂質(zhì)體制備過程中顆粒均一性及大小的問題一直是關(guān)注的焦點(diǎn).脂質(zhì)體功能的實(shí)現(xiàn)依賴于脂質(zhì)體大小及均一性[32-33].我們使用的微流控技術(shù)是脂質(zhì)體制備領(lǐng)域新興的技術(shù)，通過微流控芯片中高度受控的流體混合條件產(chǎn)生大小均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的脂質(zhì)體納米顆粒.相比于傳統(tǒng)的加熱法[34]、溶劑分散法/反溶劑法[35]、溶劑交換法[36]等制備方法，微流控技術(shù)省略了脂質(zhì)體的水合步驟和擠出步驟，只需要一步工藝即可以精確地完成不同大小和層狀的脂質(zhì)體的生產(chǎn)，且避免了脂質(zhì)體制備過程中顆粒大小不均一的問題[37].在微流控混合制備前，我們將各類脂質(zhì)在90%乙醇中37 ℃孵育1 h 以上，降低各類脂質(zhì)的溶解度，使其距離更加接近，提高脂質(zhì)體形成效率.

綜上所述，DNA-脂質(zhì)體納米顆粒經(jīng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western-blot 表明目的蛋白得到了正確高效表達(dá)，即脂質(zhì)體包被SARS-CoV-2 N 基因的候選DNA 疫苗能夠高效轉(zhuǎn)染人源細(xì)胞.下一步將開展動(dòng)物體內(nèi)免疫學(xué)的評(píng)價(jià)，為高效通用的SARS-CoV-2 LNP-DNA 疫苗的研發(fā)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ).