喻 鑫，劉 弋，周 波，曹先東

胃癌是致死率較高的一種消化道惡性腫瘤[1]，早期胃癌進(jìn)行手術(shù)治療以及轉(zhuǎn)移性胃癌進(jìn)行化療可使患者明顯獲益[2]。奧沙利鉑(oxaliplatin,Oxa)是臨床常用的胃癌化療藥物，但Oxa在臨床使用過程中經(jīng)常出現(xiàn)耐藥且副作用多[3-4]。因此，當(dāng)前急需探索新的治療方法來增加奧沙利鉑的治療效果，減少其毒副作用。

雙硫侖(disulfiram,DSF)是一種乙醛脫氫酶抑制劑，其作為一種解酒藥，已被報(bào)道具有抗腫瘤的作用[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，DSF可通過抑制Wnt/β-catenin和NF-κB通路抑制胃癌細(xì)胞生長，DSF可通過上調(diào)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)表達(dá)誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡[7]。DSF與多種化療藥物聯(lián)用可發(fā)揮協(xié)同作用，如DSF與多西他賽或順鉑聯(lián)用可協(xié)同抑制乳腺癌生長[8-9]。DSF與Oxa聯(lián)用能否發(fā)揮協(xié)同作用抑制胃癌細(xì)胞生長尚未見報(bào)道。該研究以人胃癌細(xì)胞BGC-823為研究對象，進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在探索DSF與Oxa聯(lián)用的治療效果及作用機(jī)制，為DSF老藥新用治療胃癌提供線索，為臨床DSF與Oxa聯(lián)用治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞胃癌BGC-823細(xì)胞由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗、BODIPY 581/591 C11dye (Invitrogen)購自美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技股份有限公司；DSF、Oxa、Z-VAD、NAC、Necro-1、Ferr-1購自上海藍(lán)木化工有限公司；AnnexinV/PI凋亡試劑盒、碘化吡啶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒購自于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購自于美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中以1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗)培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，梯度稀釋藥物，實(shí)驗(yàn)分為Oxa組、DSF組、Oxa+DSF組和空白組。Oxa組給予不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L) Oxa處理，DSF組給予不同濃度(0、8、16、32、64、128、256 μmol/L)DSF處理,Oxa+DSF組中每組的Oxa給藥濃度與單用組相同，Oxa與DSF給藥濃度比為1 ∶1.6。各組加藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待不同濃度的DSF與Oxa處理BGC-823細(xì)胞24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活力，使用Compu Syn軟件做協(xié)同作用曲線。

1.5 NAC、Z-VAD、Necro-1、Ferr-1抑制對細(xì)胞活力的回復(fù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC進(jìn)行細(xì)胞活力回復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、NAC組(5 mmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+NAC組；實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、Z-VAD組(40 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Z-VAD組；實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、Necro-1組(20 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+ Necro-1組；實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Ferr-1組。取對數(shù)生長期細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml,接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、NAC組(5 mmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+NAC組。取處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔板內(nèi)，待6～12 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，每組加入新的含藥培養(yǎng)基處理24 h，之后吸棄培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化BGC-823細(xì)胞后收集細(xì)胞于EP管內(nèi)，用預(yù)冷的PBS清洗一遍，離心后每管加入500 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞管，每管加入5 μl AnnexinV-FITC避光10 min后，加入5 μl PI染色，混勻避光室溫反應(yīng)10～15 min，之后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.7 BODIPY 581/591 C11 dye (Invitrogen) 染色檢測脂質(zhì)過氧化自由基(lipid ROS,LipROS)水平實(shí)驗(yàn)分為DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Ferr-1組， 取對數(shù)生長期細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml， 接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入提前稀釋好的含BODIPY 581/591 C11的新鮮培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min左右，胰酶消化細(xì)胞之后轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞管上機(jī)檢測。

1.8 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)置DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組，取對數(shù)生長期細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml， 接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理BGC-823細(xì)胞24 h后棄去培養(yǎng)基，用TRIzol法提取總RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用兩步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Takara熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 DSF與Oxa聯(lián)用抑制BGC-823細(xì)胞活力CCK-8檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示，不同濃度的DSF、Oxa處理BGC-823細(xì)胞24、48、72 h后，DSF、Oxa均能時(shí)間與劑量依耐性抑制BGC-823細(xì)胞活力(圖1A、B)。DSF與Oxa聯(lián)用時(shí)，DSF能明顯增強(qiáng)Oxa對BGC-823細(xì)胞活力抑制效果(F=382.37,P<0.001，圖1C)；用CompuSyn軟件做Farction-Effect協(xié)同作用曲線，結(jié)果顯示所有的聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)值都小于1 (CI<1)，表明DSF與Oxa聯(lián)用聯(lián)用有很好的協(xié)同作用(圖1D)。

圖1 DSF與Oxa對BGC-823細(xì)胞活力的影響

2.2 DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡和鐵死亡本實(shí)驗(yàn)使用了凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC進(jìn)行細(xì)胞活力回復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：Z-VAD處理能部分逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制(F=67.62,P<0.05,圖2A)；Necro-1處理不能逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制(F=1.52,P>0.05,圖2B)；Ferr-1處理能完全逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制(F=397.54,P<0.001,圖2C)；NAC能逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制(F=382.62,P<0.001,圖2D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果也表明NAC能部分逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用引起的細(xì)胞凋亡(F=368.12,P<0.001,圖3)。上述結(jié)果表明DSF與Oxa聯(lián)用可部分引起B(yǎng)GC-823細(xì)胞凋亡和鐵死亡。

2.3 鐵死亡抑制劑Ferr-1能逆轉(zhuǎn)DSF聯(lián)合Oxa誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測鐵死亡抑制劑Ferr-1是否能逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用后引起的胃癌細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示Ferr-1預(yù)處理BGC-823細(xì)胞后，DSF與Oxa聯(lián)用引起B(yǎng)GC-823細(xì)胞死亡(PI陽性)明顯減少，F(xiàn)err-1能逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)合誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞鐵死亡(F=402.52,P<0.001,圖4)，顯然，DSF與Oxa聯(lián)用能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡。

圖4 鐵死亡抑制劑Ferr-1預(yù)處理BGC-823細(xì)胞后用DSF與Oxa單用或聯(lián)用24 h后檢測BGC-823細(xì)胞凋亡情況

2.4 DSF聯(lián)合Oxa誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制LipROS BODIPY 581/591 C11染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，DSF與Oxa聯(lián)用能明顯誘導(dǎo)LipROS產(chǎn)生增多，鐵死亡抑制劑Ferr-1預(yù)處理BGC-823細(xì)胞后，明顯抑制DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞LipROS產(chǎn)生增多(F=530.36,P<0.001,圖5A、B)；qRT-PCR結(jié)果顯示，DSF與Oxa聯(lián)用可引起促鐵死亡調(diào)控基因PTGS2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(圖5C)，抑鐵死亡調(diào)控基因GPX4和SLC7A11 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(F=462.56,P<0.001,圖5D、E)。上述結(jié)果表明DSF與Oxa聯(lián)用明顯促進(jìn)LipROS產(chǎn)生增多，上調(diào)PTGS2 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)GPX4和SLC7A11 mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞鐵死亡。

圖5 DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞鐵死亡

3 討論

Oxa作為第三代鉑類藥物，對轉(zhuǎn)移性胃癌有很好的效果，在臨床使用中由于易發(fā)生耐藥和毒副作用，目前仍有許多局限性[10]，聯(lián)合用藥是一種很好的增效減毒的方法，因此急需找到有效的可增敏Oxa的藥物。DSF為常見的戒酒藥，二價(jià)過渡金屬離子螯合劑，具有價(jià)格低廉、細(xì)胞毒性及良好的抗腫瘤效果等優(yōu)勢，有望作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床[11]。DSF可通過抑制Wnt/β-catenin和NF-κB等通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[6]。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，DSF與多種化療藥物聯(lián)用可協(xié)同抑制腫瘤生長，如DSF與銅(Cu)聯(lián)合作用可通過下調(diào)Casepas-3蛋白表達(dá)、上調(diào)Casepas-8蛋白，進(jìn)而通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白抑制胃癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制胃癌生長作用；DSF與Cu聯(lián)合作用也可以通過調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)和Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用[13]；DSF與多西他賽或順鉑聯(lián)用可協(xié)同抑制乳腺癌生長[8-9]。DSF聯(lián)用Oxa是否能發(fā)揮對胃癌細(xì)胞生長起協(xié)同作用不清楚，同時(shí)兩者聯(lián)用的作用機(jī)制也有待闡明。本研究以BGC-823細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和LipROS變化情況及qRT-PCR來探索DSF與Oxa聯(lián)用可誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞鐵死亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，DSF與Oxa聯(lián)用可時(shí)間和劑量依賴性抑制BGC-823細(xì)胞活力。為了探索DSF與Oxa聯(lián)用的作用機(jī)制，本研究使用凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC,進(jìn)行了細(xì)胞活力回復(fù)實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)DSF與Oxa聯(lián)用可部分誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡，活性氧抑制劑NAC可以逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡。鐵死亡是一種區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞自噬的新型細(xì)胞程序性死亡方式[14]，其是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化引發(fā)的新的死亡方式[15]，鐵死亡過程中常出現(xiàn)LipROS[16]，同時(shí)促鐵死亡標(biāo)記物PTGS2表達(dá)上升和抑鐵死亡標(biāo)記物GPX4、SLC7A11水平表達(dá)下調(diào)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制劑Ferr-1可在一定程度上逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用引起的BGC-823細(xì)胞活力下降和細(xì)胞死亡，同時(shí)鐵死亡抑制劑Ferr-1能部分逆轉(zhuǎn)DSF與Oxa聯(lián)用引起的BGC-823細(xì)胞LipROS產(chǎn)生增多，表明兩藥聯(lián)用主要是通過誘導(dǎo)LipROS產(chǎn)生增多促進(jìn)BGC-823細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。qRT-PCR結(jié)果也進(jìn)一步提示DSF與Oxa聯(lián)用可上調(diào)促鐵死亡PTGS2 mRNA表達(dá)水平和下調(diào)抑鐵死亡GPX4和SLC7A11 mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DSF與Oxa發(fā)揮明顯協(xié)同作用誘導(dǎo)BGC-823胃癌細(xì)胞鐵死亡。DSF與Oxa聯(lián)用誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡將為臨床DSF老藥新用提供線索，為DSF與Oxa聯(lián)合用藥治療胃癌提供理論指導(dǎo)。