仝幀翰，劉青青，張嚴(yán)玲，王雷立，李安然，董柯清，王聞琦，王盼盼，王翠玲

(河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471023)

生物鐘(Circadian clock)是植物中一種重要的計時機(jī)制，通過感受外部環(huán)境因子的晝夜周期變化并相應(yīng)地協(xié)調(diào)生物過程，從而在最有利的晝夜和季節(jié)時間來分配資源[1-3]。開花所需的特定光照時間被稱為光周期，生物鐘是光周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組成部分。在光周期途徑中，光感受器感知光信號并將其傳遞給生物鐘，生物鐘產(chǎn)生生物節(jié)律并轉(zhuǎn)移到下游調(diào)節(jié)基因[4]。CO-like、CO、TOC1三類包含CCT(Co-like CO and TOC1)結(jié)構(gòu)域的基因，是光周期誘導(dǎo)的開花調(diào)控途徑中重要組成部分。CCT基因最早在擬南芥中鑒定，該基因存在43～45 個氨基酸組成的保守CCT 功能域。CCT 基因家族根據(jù)其基序組成的不同，可分為COL(Constans Like)、CMF(CCT Motif Family)和PRR(Pseudo-Response Regulator)3 個亞家族[5]。除了CCT 結(jié)構(gòu)域外，COL 蛋白還具有一個或兩個B-box[6]，CMF 蛋白僅包含CCT 結(jié)構(gòu)域，而PRR 蛋白除了羧端的CCT 結(jié)構(gòu)域外，在氨基端還包含REC 結(jié)構(gòu)域。CCT 基因家族不同成員在開花、脅迫等多種生命活動及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，具有多樣性的基因功能。作為CCT 基因家族的一個重要亞家族，PRR 基因家族成員參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、開花的光周期反應(yīng)，并且在控制非生物/生物脅迫反應(yīng)和其他生長發(fā)育等途徑中發(fā)揮重要作用[7-9]。目前，除在擬南芥[10-11]和水稻中[12-13]PRR 基因研究較充分外，在少數(shù)重要作物如大麥[14]、玉米[15]、高粱[16]、小麥[17-19]等也有少量研究。PRRs在模式植物擬南芥中的研究已經(jīng)相當(dāng)清晰，其中TOC1(Timing of CAB1)基因作為植物晝夜節(jié)律系統(tǒng)的中心振蕩器，調(diào)節(jié)光周期開花反應(yīng)[10]。在植物中，光周期基因通過影響從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段過渡的時間，調(diào)控植物生長[20]。PRR是高度保守的蛋白，目前在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)的PRR 家族都由5 個PRR 基因家族成員組成，所有成員都擁有N 端的REC 結(jié)構(gòu)域和C 端的CCT 結(jié)構(gòu)域。

生物鐘影響植物的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而PRR1基因作為PRR 家族成員在生物鐘的輸入和輸出途徑中扮演著重要角色。在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，PRR1基因表達(dá)增加會促進(jìn)CCA1和LHY基因的表達(dá)，而PRR1過表達(dá)卻會導(dǎo)致CCA1和LHY的表達(dá)量降低[21]；OsPRR1會對冷脅迫的刺激做出反應(yīng)[22]；HvPRR1可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和調(diào)控開花[23]。玉米屬于短日照作物，對光敏感的臨界日照時數(shù)為12～13 h，隨著光照時間的延長，玉米在生長過程中表現(xiàn)出諸多不適[24]。目前對PRR基因的研究主要集中在擬南芥等植物中[25]，玉米中PRR基因的研究鮮有報道。本研究克隆獲得ZmPRR1-1的啟動子序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期對ZmPRR1-1啟動子的調(diào)控核心區(qū)域、潛在的順式元件等進(jìn)行詳細(xì)分析，為進(jìn)一步研究該基因的調(diào)控方式、基因功能及可能參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

挑選籽粒圓潤飽滿、大小一致的玉米黃早4 種子，播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，在培養(yǎng)室(25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗，相對濕度70%)中培養(yǎng)至3 葉1 心時，對玉米葉進(jìn)行取樣，經(jīng)液氮速凍后放置在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmPRR1-1啟動子的克隆

按照植物DNA 提取試劑盒(Plant DNA Fastmini Isolation Kit，貝貝生物科技有限公司)說明書提取玉米自交系黃早4 的基因組DNA。在MaizeGDB基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org)中下載玉米自交系CML247 中ZmPRR1-1啟動子序列，在ZmPRR1-1基因ATG 上游2 624 bp 處設(shè)計特異性引物，命名為 ZmPRR -F: 5′ -TCTCGCCCTTACACTTTG-3′、ZmPRR-R:5′-CTATCATTACAAGCCATCGT-3′。以黃早4 的DNA 為模板使用KOD FX 酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中62 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 50 s，35 個循環(huán)。電泳檢測PCR 產(chǎn)物并回收目的條帶，將其連接到pEasy-BluntSimple 克隆載體上，進(jìn)行后續(xù)測序。引物合成及產(chǎn)物測序委托上海生工生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.2 玉米ZmPRR1-1啟動子序列的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 軟件對玉米CML247 和黃早4的ZmPRR1-1啟動子序列進(jìn)行比對；利用Neural Network Promoter Prediction 預(yù)測啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與核心區(qū)域(http://www.fruitfly.org/)；利用PlantCARE 預(yù)測啟動子潛在作用元件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)；利用PlantRegMap 預(yù)測啟動子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)，設(shè)置物種為玉米；利用MethPrimer 預(yù)測啟動子區(qū)域可能存在的CpG 島(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmPRR1-1 基因啟動子的克隆

根據(jù)參考序列在ZmPRR1-1基因ATG 上游2 624 bp 處設(shè)計特異性引物。以玉米自交系黃早4的DNA 為模板進(jìn)行PCR，電泳后得到一條2 600 bp左右的條帶(圖1)，切膠回收目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑單克隆測序。測序得到2 603 bp 的序列，將測序結(jié)果與玉米CML247 中ZmPRR1-1基因啟動子序列進(jìn)行序列比對分析(圖2)，二者相似性為98.59%，說明CML247 與黃早4 中ZmPRR1-1的啟動子在序列結(jié)構(gòu)上相對保守。兩者之間的序列存在7 個單堿基的SNP(單核苷酸多態(tài)性)，1 個雙堿基的InDel(插入缺失)和2 個片段的InDel。

圖1 ZmPRR1-1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis detection results of ZmPRR1-1 PCR amplification products

2.2 玉米ZmPRR1-1 啟動子核心區(qū)域預(yù)測

啟動子的核心區(qū)域是保證RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的DNA 序列，它包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的TATA 區(qū)?；蜣D(zhuǎn)錄的起點(diǎn)是指與DNA 堿基互補(bǔ)配對形成新RNA 的首個堿基位點(diǎn)。使用BDGP 在線工具進(jìn)行玉米ZmPRR1-1啟動子核心區(qū)域的預(yù)測分析，以預(yù)測值0.8 作為判斷的截斷值。結(jié)果表明玉米ZmPRR1-1啟動子中可能存在兩處核心啟動子區(qū)域(表1)，分別位于-1 234～-1 184、-250～-200 bp 區(qū)域，預(yù)測分值分別為:0.94 和0.89，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為:A、G，由于0.94＞0.89，推測該基因核心啟動子區(qū)域很可能位于-1 234～-1 184 bp 處，可能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域為:TTTTGTTTATATACATATGAAGGGGTGTATC CCTTGGGAA(A)ATATGTCGT，啟動子核心區(qū)域中含有典型的TATA-box 元件。

表1 ZmPRR1-1 啟動子核心區(qū)域Table 1 Core region of ZmPRR1-1 Promoter

2.3 玉米ZmPRR1-1 啟動子順式作用元件的預(yù)測

啟動子上分布的順式作用元件能有效反映該基因受到外界因子的潛在調(diào)控，所以通過分析啟動子的順式作用元件能了解基因可能的調(diào)控機(jī)制及參與的生命活動[26]。利用在線分析工具Plant Care 對得到的ZmPRR1-1啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析(圖2)，結(jié)果表明:ZmPRR1-1啟動子序列中存在豐富且類型多樣的順式作用元件，除了TATA-box(25 個)、CAAT-box(25 個)等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還存在多種順式作用元件與光響應(yīng)有關(guān)，例如ACE(1個)、AE-box(1 個)、AT1-motif(1 個)、G-box(9個)、Sp1(2 個)，暗示玉米ZmPRR1-1啟動子對光因素存在多種響應(yīng)方式[27]。其次，ZmPRR1-1啟動子中還存在多種激素應(yīng)答元件，如脫落酸應(yīng)答元件ABRE(8 個)、赤霉素應(yīng)答元件P-box(1 個)、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element(1 個)、生長素響應(yīng)元件TGA-box(1 個)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif(1 個)和TGACG-motif(3 個)。另外也存在脅迫相關(guān)的順式作用元件包括干旱誘導(dǎo)元件MBS(1個)、缺氧特異性誘導(dǎo)元件GC-motif(4 個)。當(dāng)外界環(huán)境因子發(fā)生變化時，這些元件會發(fā)生反應(yīng)，提高植物抗逆性。另外，還鑒定到參與細(xì)胞周期的順式元件MSA-like(2 個)；參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site(1 個)；參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控元件TC-rich repeats(1 個)以及一些未知元件。

圖2 CML247 與黃早4 ZmPRR1-1 基因的啟動子序列比對結(jié)果Fig.2 Results of promoter sequence alignment between CML 247 and Huangzao4 ZmPRR1-1

圖3 ZmPRR1-1 啟動子順式作用元件預(yù)測Fig.3 Prediction of cis-acting elements of ZmPRR1-1 promoter

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，CML247 和黃早4 中Zm-PRR1-1啟動子共享眾多順式元件，暗示兩種自交系中ZmPRR1-1的啟動子可能有相似的調(diào)控機(jī)制與基因功能。與CML247 相比，黃早4 中ZmPRR1-1啟動子在ATG 上游2 104 bp 處堿基發(fā)生T→G 的單堿基突變，導(dǎo)致了在黃早4 中ZmPRR1-1啟動子調(diào)控區(qū)域出現(xiàn)新的G-box 元件。

以上分析表明，玉米ZmPRR1-1基因啟動子可受多種外界信號或轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)節(jié)玉米ZmPRR1-1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并可能參與植物光周期、生長發(fā)育、逆境脅迫和激素誘導(dǎo)響應(yīng)等多種生命活動及生理過程。

2.4 玉米ZmPRR1-1 啟動子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析

啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)TFBS(transcription factor binding site)是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA 片段，它們是轉(zhuǎn)錄開始的關(guān)鍵結(jié)合部位[27]。研究表明TFBS 具有保守性[28]，有相同或相似的序列就可結(jié)合相同的轉(zhuǎn)錄因子[29]。使用PlantRegMap 在線工具對ZmPRR1-1啟動子的TFBS 進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明存在33 個TFBS，涉及到ERF、LBD、BBRBPC、MIKC_MADS、WRKY 和GRAS 共6 種轉(zhuǎn)錄因子家族，其中ERF 家族的結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)了23 次。預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些TFBS 分布在ZmPRR1-1基因啟動子的正負(fù)鏈上，推測該啟動子具有豐富的調(diào)控機(jī)制，啟動ZmPRR1-1基因的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)不同轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄起始參與行使不同的生物學(xué)功能。

表2 ZmPRR1-1 啟動子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Table 2 Prediction of binding sites of transcription factors of ZmPRR1-1 promoter

2.5 玉米ZmPRR1-1 啟動子CpG 島的預(yù)測

基因上富含連續(xù)未甲基化CG 堿基的區(qū)域稱為CpG 島，主要存在于基因的啟動子和外顯子上，研究發(fā)現(xiàn)啟動子CpG 島影響基因表達(dá)效率以及表達(dá)水平。使用MethPrimer 在線工具預(yù)測玉米ZmPRR1-1啟動子的CpG 島，預(yù)測CpG 島參數(shù)設(shè)置為GC ＝50%，ObsCpG/ExpCpG＝0.6，長度＝100 bp。預(yù)測分析顯示，玉米ZmPRR1-1啟動子序列存在4 個CpG島分布區(qū)域，分布區(qū)域分別位于-2 329～-1 921、-1 716～-1 332、-910～-740、-696～-53 bp，長度分別為409、385、171、644 bp(圖4)。暗示這些區(qū)域可能對啟動子調(diào)控基因產(chǎn)生一定的影響。

圖4 ZmPRR1-1 啟動子CpG 島預(yù)測Fig.4 Prediction of CpG island of ZmPRR1-1 promoter

3 討論

PRR 家族基因是中央振蕩器的重要組成部分，參與到植物光周期控制的開花途徑中，并發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，且可通過調(diào)控脫落酸的合成，影響植物抗逆性，調(diào)控植物光周期控制的開花和生長發(fā)育。Alabadi 等[20]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TOC1會使CCA1、LHY表達(dá)量維持較高水平，減少mRNA 信號，從而導(dǎo)致負(fù)反饋回路。Klein 等[30]發(fā)現(xiàn)，TOC1能夠結(jié)合到ABA 基因啟動子上抑制ABAR、CBF、ABI3 等基因表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥的生物鐘。本研究通過克隆玉米自交系黃早4 的ZmPRR1-1啟動子，采用生物信息學(xué)方法對ZmPRR1-1啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及核心區(qū)域、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及CpG 島進(jìn)行預(yù)測及分析，結(jié)果表明ZmPRR1-1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG 上游1 175 bp 的A，附近有赤霉素響應(yīng)元件ABRE 和光響應(yīng)元件AT1-motif，暗示赤霉素合成與光周期調(diào)控可能是ZmPRR1-1參與的兩個重要生長調(diào)節(jié)途徑。而在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)ERF 結(jié)合位點(diǎn)，ZmPRR1-1可能通過調(diào)控ERF 起始轉(zhuǎn)錄參與生命活動。此外，在其附近沒有發(fā)現(xiàn)CpG 島區(qū)域，此基因甲基化調(diào)控不受核心區(qū)域影響。

TATA-box 作為核心啟動子元件，可以被RNA聚合酶識別調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始。順式作用元件分析顯示，ZmPRR1-1基因啟動子具有典型高活性啟動子具備的TATA-box 和CAAT-box 等基本元件；由于順式作用元件影響，植物逆境脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)存在多種響應(yīng)方式[31]。在ZmPRR1-1啟動子中鑒定到4 種光響應(yīng)元件，表明玉米ZmPRR1-1啟動子對光因素可能存在多種響應(yīng)方式，光響應(yīng)元件在啟動子調(diào)控區(qū)域的富集也與ZmPRR1-1在光周期中的重要作用相匹配。有研究表明，脫落酸應(yīng)答元件ABRE 在脫落酸存在的情況下與轉(zhuǎn)錄因子EmBP-1相互作用能顯著增強(qiáng)Em基因的表達(dá)，從而提高小麥的抗旱性[32]；干旱脅迫下，玉米中脫落酸誘導(dǎo)ZmPYL9基因表達(dá)，增強(qiáng)玉米抗旱能力[33]；脫落酸還能增加玉米可溶性糖的含量，提高玉米品質(zhì)[34]。Shakirova 等[35]發(fā)現(xiàn)，水楊酸可通過改善玉米的滲透調(diào)節(jié)能力和加速淀粉轉(zhuǎn)化來緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。許高平等[36]的研究表明，赤霉素可有效提高玉米幼苗的抗寒抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)，Zm-PRR1-1啟動子存在多種激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸反應(yīng)元件TCA-element 和赤霉素反應(yīng)元件P-box，暗示ZmPRR1-1可能通過參與脫落酸、水楊酸和赤霉素合成來調(diào)控植物生長發(fā)育。CML247 與黃早4 中ZmPRR1-1的啟動子序列有98.59%的同源性，暗示兩自交系中ZmPRR1-1的啟動子存在相似的調(diào)節(jié)模式和功能。該啟動子中，有Sp1 和GC-motif 兩種順式作用元件位于ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域內(nèi)，是兩種擁有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的順式元件，推測ZmPRR1-1可能通過調(diào)控ERF起始轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)玉米的生長發(fā)育。

結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果表明，ZmPRR1-1的啟動子可以與ERF、LBD、BBR-BPC、MIKC_MADS、WRKY和GRAS等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合共同作用影響玉米生長，眾多結(jié)合位點(diǎn)位于CpG 島區(qū)域內(nèi)，暗示Zm-PRR1-1的啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始受甲基化影響。

啟動子根據(jù)是否含有CpG 島可分為CpG 島啟動子和非CpG 島啟動子，啟動子CpG 島調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，影響轉(zhuǎn)錄效率和轉(zhuǎn)錄水平。CpG 島預(yù)測Zm-PRR1-1啟動子序列中有4 個CpG 島，CpG 島中存在數(shù)量眾多的順式作用元件，推測ZmPRR1-1啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始可能受甲基化影響。

4 結(jié)論

本研究克隆了玉米自交系黃早4 中ZmPRR1-1的啟動子，同時對啟動子核心區(qū)域、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和CpG 島進(jìn)行分析。啟動子中既含有核心啟動子元件，也含有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。表明:(1)ZmPRR1-1的啟動子具有基本啟動子活性和調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的功能。(2)ZmPRR1-1啟動子區(qū)域富含多種順式元件，暗示該基因啟動子除響應(yīng)光周期重要調(diào)控外，還可能響應(yīng)干旱、缺氧等脅迫，推測ZmPRR1-1具有一因多效功能。綜合數(shù)據(jù)及研究結(jié)果表明，克隆得到的ZmPRR1-1基因啟動子具有控制轉(zhuǎn)錄起始及調(diào)控多樣性的能力。相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能提供了研究方向，為進(jìn)一步解析ZmPRR1-1啟動子調(diào)控機(jī)制、基因功能及基因上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。