李蔣鳳,肖靜靜,何東初,

(1. 湖北中醫(yī)藥大學,湖北 武漢 430060；2. 中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種可導致進行性關節(jié)破壞和血管、代謝、骨骼、心理領域等疾病共病的慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]。其臨床特征多以手、手腕、腳和膝蓋的疼痛和腫脹為主(多發(fā)性關節(jié)炎)，可受累其他關節(jié)，也可能出現單性關節(jié)炎或少關節(jié)炎，發(fā)展后期引起慢性炎癥和不可逆的關節(jié)或其他器官損傷，表現為多個疾病亞群的臨床綜合征，如間質性肺病、心包炎、胸腔積液或支氣管擴張等[2]。RA的全球發(fā)病率約為0.5%～1%，關節(jié)損傷和殘疾的結果嚴重影響工作和生活，并且增加死亡率，對女性的影響尤為劇烈，通常是男性的2～3倍[3]。研究表明，免疫介導的基質組織失調是慢性炎癥和關節(jié)破壞的病理基礎，RA前階段持續(xù)數月至數年，其特征是存在循環(huán)自身抗體、炎癥細胞因子和趨化因子的濃度及范圍升高、代謝改變，臨床發(fā)病階段主要病理變化為滑膜炎合并血管、代謝、骨骼等系統(tǒng)的紊亂[4]。近年，盡管小分子激酶抑制劑和生物制劑的開發(fā)大大改善了臨床結果，但仍不能達到免疫平衡和無藥物緩解的治愈目標，且治療費用昂貴，價格因地區(qū)和國家而異，每年從10 000美元到36 000美元不等[3，5]。因此，尋找更有效的具有調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)、減輕炎癥、緩解共病多重作用且價格低廉的藥物仍是廣大臨床患者的迫切需求。

中醫(yī)藥基于整體觀念以患者臨床癥狀與證候為靶點，具有彌補西藥靶點單一、藥效單一的特點，辨證組方論治常收效頗好。RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，痹癥寧方為常用治療RA的經驗用方，歷時十余年，多次精簡化裁，臨床使用安全且不良反應少[6]。痹癥寧方以“痹癥”名方獨活寄生湯為基礎，祛風除濕時著重于溫陽通絡、疏肝調脾腎，以附子、青風藤、威靈仙為君藥，溫寒散風、除濕通絡，以合《素問·痹癥論》“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”之言；臣以細辛、桂枝、獨活、徐長卿、生薏苡仁，獨活善治伏風，除下焦筋骨之風寒濕邪，配伍細辛入少陰腎經溫化陰經，桂枝入太陽膀胱經溫經散寒、通利血脈，與細辛共治表里之寒濕，加用徐長卿益氣入肝胃、生薏苡仁清熱健脾腎；佐以當歸、赤芍、白芍、鹿角膠養(yǎng)血和血、疏肝強骨，且血肉有情之品尤善填精益髓健脾，配伍生地清熱涼血，除血虛、血瘀之熱，加入地龍、蜈蚣搜風通絡；使以甘草調和諸藥。系統(tǒng)網絡藥理學是以藥物作用的網絡分析為途徑之一，將系統(tǒng)方法、計算方法和實驗方法相結合來闡明藥物的分子機制的方法，可以較好地用于分析具有復雜性、多成分、多靶點的中草藥和中藥方劑[7]。本研究擬從網絡藥理學及分子對接的角度，探索痹癥寧方抗RA的分子機制，為其臨床應用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1痹癥寧方有效成分和作用靶點篩選 將痹癥寧方的主要藥物利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP數據庫檢索得到藥物有效成分，并按照口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)兩個關鍵參數對成分進行篩選，篩選條件為OB≥30%并且DL≥0.18。其次，記錄篩選后有效成分的MOL編號并在平臺“Related Targets”項目下對每個成分分別進行檢索得到藥物有效成分相應的靶點基因名稱。最后，在STRING數據庫中將藥物有效成分相應的靶點基因名稱轉換成gene symbol。佐藥中地龍、蜈蚣、鹿角膠、生地黃藥物則利用BATMAN-TCM數據庫檢索進行補充，篩選條件為score≥20，Adjusted P-value≤0.05，得到藥物的有效成分和靶點基因。

1.2痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎的靶點預測 利用GeneCards、OMIM數據庫檢索“rheumatoid arthritis”，并將兩個數據庫中檢索到與類風濕關節(jié)炎疾病相關的基因合并去重作為疾病的相關靶點基因。將痹癥寧方有效成分的靶點基因與類風濕關節(jié)炎疾病相關的靶點基因取交集，得到痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎的預測靶點，利用Venn軟件繪制維恩圖交集圖。根據痹癥寧方有效藥效成分、藥效成分相對應的靶點基因與類風濕關節(jié)炎疾病相關靶點基因，使用Cytoscape3.6.0 軟件建立“方藥配伍-有效成分-作用靶點-治療疾病”的映射圖。

1.3蛋白質相互作用網絡的構建 首先，將痹癥寧方有效成分抗類風濕關節(jié)炎疾病的預測靶點基因導入到STRING數據庫，且將物種限定為人，繪制蛋白質相互作用網絡，綜合評分(z-score)大于0.4的為具有顯著統(tǒng)計學意義，并輸出“TSV”格式的結果，然后在Cytoscape軟件中對結果進行修飾美化。

1.4GO和KEGG功能富集分析 將痹癥寧方有效成分抗類風濕關節(jié)炎疾病的預測靶點基因，利用R軟件中的“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”等package在基因本體聯合會(GO)及京都基因和基因組百科全書(KEGG)數據庫中進行功能和信號通路富集分析。最后，在R語言中將富集信息用圖形來展示，以校正后的P值小于0.05為有顯著的統(tǒng)計學意義。

1.5關鍵基因的篩選及其生物學過程分析 將預測的痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎的靶點導入到Cytoscape軟件中，利用Cytohubba插件中四種不同算法，分別為：degree，radiality，MCC(maximal clique centrality)和 EPC(edge percolated component)，篩選出關鍵基因。同時，在STRING數據庫，物種設置為人，繪制蛋白質相互作用網絡，綜合評分(z-score)大于0.4的為具有顯著統(tǒng)計學意義。同1.4中利用R軟件進行GO中生物學過程富集分析，以校正后的P值小于0.05為有顯著的統(tǒng)計學意義。

1.6分子對接驗證 利用Autodock(4.2.6)軟件作為分子對接軟件，對有效成分小分子和靶標蛋白質進行半柔性對接。選取關鍵基因中得分前5的基因所對應的蛋白質為靶標蛋白質，并在PDB數據庫中下載其三維結構數據PDB格式。在PyMol(2.1.1)軟件中將靶點蛋白的自身配體、水分子、重復序列清除。在AutoDockTools(1.5.6)軟件對清理好靶點蛋白進行加氫、計算電荷、添加蛋白質類型，并保存為靶標蛋白“pdbqt”格式文件。其次，找到相應靶點的藥物有效成分，并在ZINC、Pubchem數據庫中下載其三維結構數據“mol2”或“sdf”格式，并可用OpenBabel(2.4.1)軟件將“sdf”格式轉換成“mol2”格式。在AutoDockTools軟件中將每個成分進行加氫、計算電荷、加Root后，保存為小分子“pdbqt”格式文件。分別用處理好的靶標蛋白質與有效成分小分子利用Autodock軟件進行對接，使用OpenBabel軟件將PDBQT格式的對接文件轉化為PDB格式，最后利用Pymol軟件分析和觀察小分子與靶標蛋白對接結果。

2 結 果

2.1痹癥寧方有效成分和作用靶點的篩選結果篩選后得到君藥附子、青風藤、威靈仙有效成分數各為：6個、4個、2個，靶點基因數各為：19個、51個、45個；臣藥細辛、桂枝、獨活、徐長卿、薏苡仁有效成分數各為7個、5個、5個、3個、3個，靶點基因數各為99個、44個、42個、13個、27個；佐藥當歸、赤芍、白芍、生地、地龍、蜈蚣、鹿角膠有效成分數各為：2個、10個、7個、4個、7個、5個、2個，靶點基因數各為45個、92個、83個、217個、305個、225個、13個；使藥甘草有效成分數為18個，靶點基因數為134個。將君臣佐使藥物有效成分和靶點基因合并后去重，得到君藥有效成分數為11個，靶點基因數為65個；臣藥有效成分數為21個，靶點基因數為124個；佐藥有效成分數為29個，靶點基因數為669個；使藥有效成分數為18個，靶點基因數為131個。最后，將痹癥寧方所有藥物有效成分和靶點基因合并后去重，得到總有效成分數69個，總靶點基因數727個，見表1。

表1 痹癥寧方有效成分與靶點基因的篩選 個

2.2預測痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎疾病的靶點通過GeneCards、OMIM數據庫對類風濕關節(jié)炎疾病進行檢索共得到340個與類風濕關節(jié)炎相關的基因。將痹癥寧方中君臣佐使藥物有效成分對應的靶點基因與類風濕關節(jié)炎疾病相關的靶點基因取交集，獲得56個痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎疾病潛在的靶點，并利用Venn軟件實現可視化(見圖1)。將痹癥寧方君臣佐使4種藥物配伍、34個主要有效成分、56個潛在靶點、類風濕關節(jié)炎疾病輸入到Cytoscape軟件，構建“方藥配伍-有效成分-作用靶點-治療疾病”的網絡圖(見圖2)。

圖1 痹癥寧方配伍與類風濕關節(jié)炎共同靶點韋恩圖

圖2 痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎“方藥配伍-有效成分-作用靶點-治療疾病”的網絡圖

網絡圖的節(jié)點分別表示藥物配伍、有效成分、靶點基因、疾病，邊表示的是藥物配伍、有效成分、靶點基因、疾病之間的聯絡關系。在痹癥寧方抗RA的主要活性成分中，君藥2個，臣藥13個，佐藥17個，使藥7個，君臣佐藥物共有的活性成分為beta-sitosterol，臣佐使藥物共有的活性成分為kaempferol，臣佐藥物共有的活性成分為(+)-catechin。君臣佐使藥物與類風濕關節(jié)炎均共有的靶點基因為PTGS2、PTGS1、JUN。

2.3蛋白質網絡互作和功能富集分析結果 在STRING數據庫中設置minimum required interaction score為0.4，獲取average node degree為23.1并且由56個節(jié)點和648條邊所映射組成痹癥寧方抗RA的靶點基因相互作用圖(見圖3)。在R軟件中對痹癥寧方抗RA的作用靶點進行GO和KEGG富集分析，總共獲得1 507條記錄，其中生物學過程(BP)1 447條，主要涉及炎癥反應的調節(jié)、DNA結合轉錄因子活性的調節(jié)、活性氧代謝過程、細胞趨化作用、對脂多糖的反應、白細胞趨化性、對細菌源分子的反應、骨髓白細胞遷移、細胞對化學應激的反應等；細胞組分(CC)19條，主要關聯細胞膜與質膜、胞質囊腔、分泌顆粒內腔等；分子功能(MF)41條，主要具有整合素結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、細胞因子活性、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受體結合、生長因子受體結合、信號受體激活因子的活性、抗氧化活性等功能(見圖4)。KEGG富集通路共115條，選取前30條進行可視化(見圖5)，其中與類風濕關節(jié)炎通路相關的基因有IL6、FOS、CXCL8、VEGFA、ITGB2、ITGAL、TGFB2、TNFSF11、IL1B、ICAM1、MMP1、JUN、TGFB1。由此可見中藥復方參與人體多個復雜的生物學過程與通路，整體調節(jié)人體物質代謝。

圖3 痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎靶點的蛋白互作網絡圖

圖4 痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎靶點的GO富集圖

圖5 痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎靶點的KEGG富集圖

2.4關鍵基因的篩選結果與生物過程學分析 利用Cytohubba插件對痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎的潛在靶點進行關鍵基因分析，根據degree、radiality、MCC、EPC 4種算法分別取得分前10的基因，再取交集，得到7個關鍵基因，分別為IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN,見表2。更進一步對關鍵基因進行生物學過程分析，發(fā)現主要涉及正向調節(jié)血管生成和發(fā)育、細胞及白細胞趨化性、神經炎癥反應、平滑肌細胞增殖的正調控、對脂多糖及細菌源分子的反應等過程，見圖6。

圖6 痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎關鍵基因的生物學過程圖

表2 關鍵基因的篩選

2.5分子對接驗證分析 選取前5個關鍵基因所對應的蛋白質為靶標蛋白質，與藥物有效成分進行分子對接，進一步驗證藥物作用的分子機制。藥物的主要作用成分有paeoniflorin、Guanidine、ellagic acid、Tyrosin、sesamin、Xanthinin，靶標基因主要為IL6、IL1B、VEGFA、CXCL8、IL10。痹癥寧方的主要有效成分的結合能均小于0(見表3)，說明其能與靶點產生自發(fā)性結合。利用PyMol繪制藥物主要有效成分與靶點蛋白質對接模式圖，以結合距離最短為最優(yōu)結合方式(見圖7)。paeoniflorin-IL6的結合位點為ARG-113氨基酸殘基，Guanidine-IL1B的結合位點為GLU-51氨基酸殘基，Tyrosin-CXCL8的結合位點為LYS-42氨基酸殘基，ellagic acid-CXCL8的結合位點為LYS-11氨基酸殘基，sesamin-IL10的結合位點為PHE-111氨基酸殘基，Xanthinin-IL10的結合位點為GLY-58氨基酸殘基，ellagic acid-VEGFA的結合位點為GLU-67氨基酸殘基。從總體上進行推測，分子對接顯示痹癥寧方的主要有效成分與核心靶點有較好的結合活性。

注：(a)表示paeoniflorin與IL6的結合位點為ARG-113氨基酸殘基;(b)表示Guanidine與IL1B的結合位點為GLU-51氨基酸殘基;(c)表示Tyrosin與CXCL8的結合位點為LYS-42氨基酸殘基;(d)表示ellagic acid與CXCL8的結合位點為LYS-11氨基酸殘基;(e)表示sesamin與IL10的結合位點為PHE-111氨基酸殘基;(f)表示Xanthinin與IL10的結合位點為GLY-58氨基酸殘基;(g)表示ellagic acid-VEGFA的結合位點為GLU-67氨基酸殘基

表3 分子對接結合能的結果

3 討 論

近年來根據基因多態(tài)性及其易感性，從基因靶點新角度挖掘調節(jié)RA中先天免疫與后天免疫的疾病修飾療法的研究越來越多[8]。RA以免疫介導的慢性炎癥為基礎，抗炎藥物(非甾體類抗炎藥、緩解病情抗風濕藥、糖皮質激素)雖然能夠緩解或者抑制炎癥，但停藥后仍易復發(fā)且不良反應多，不能從根本上調節(jié)內免疫穩(wěn)態(tài)環(huán)境和平衡炎癥反應。在前期研究中，已經證實了痹癥寧方可阻抑滑膜組織中MMP-9、MMP-3的表達，并使血清炎癥因子ESR、CRP減少，緩解關節(jié)炎指數評分，具有抗炎消腫、調節(jié)免疫的作用[9]?，F基于系統(tǒng)網絡藥理學和分子對接技術，擬從基因層面進一步揭示痹癥寧方抗類風濕關節(jié)炎的作用機制及其靶點。

痹癥寧方抗RA的主要有效成分有β-谷固醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、(+)兒茶素[(+)-catechin]等；潛在靶點有IL6、MMP2、FOS、CXCL8等。目前，已有研究證實β-谷固醇、山柰酚、兒茶素具有抗炎作用，抑制RA-FLS異常增殖和侵襲[10-12]。其中，56個潛在靶點的GO富集結果表明主要參與對細菌源分子及脂多糖的反應、炎癥反應的調節(jié)、細胞趨化作用、白細胞趨化性、骨髓白細胞遷移、活性氧代謝過程、DNA結合轉錄因子活性的調節(jié)、細胞對化學應激的反應等生物學過程，具有的分子功能主要與細胞因子如TNF、生長因子受體結合、抗氧化活性等功能相關。RA除了伴隨著由細胞因子和交叉反應(自身)抗原介導的長期炎癥，也存在一種(休眠)微生物組，它可以釋放強效炎癥原脂多糖，從而激活細胞因子如IL-6、TNF-α催化炎癥發(fā)生以及促進細胞毒性β-淀粉樣蛋白的形成[13]。在RA持續(xù)炎癥中，促炎細胞因子如TNF和IL-1β等細胞因子激活成纖維細胞樣滑膜細胞，誘導生產如炎性分子和基質降解酶，增強白細胞和巨噬細胞的活躍性，進一步侵襲和破壞周圍組織[14]。雖然RA以慢性全身性炎癥為主，但長期激活狀態(tài)下免疫細胞和基質細胞對生物能量和生物合成的需求也在增加，滑膜細胞代謝的改變和局部缺氧、缺乏營養(yǎng)的微環(huán)境在RA關節(jié)的病理表現中尤為突出，其中代謝變化是由響應營養(yǎng)、能量和氧水平以及生長因子、模式識別和細胞因子受體的信號通路協(xié)調的[15]。表觀基因組上相似的區(qū)域存在于RA細胞中，與活性增強子和啟動子以及特定的轉錄因子結合基序有關，當重塑表觀基因組或改變增強子活性時，可以調節(jié)侵掠性RA成纖維細胞樣滑膜細胞行為[16]。當DNA修復機制的表觀調節(jié)功能異常，氧化應激誘導內源性DNA損傷的積累，可能觸發(fā)細胞凋亡，引起自身抗體、受損細胞溶膠DNA和微核的產生，導致全身免疫性疾病表達[17]。據此，痹癥寧方可以從細菌源頭(血液微生物環(huán)境)、炎癥反應(促炎因子和免疫系統(tǒng))、局部缺氧及代謝改變(氧糖代謝)、表觀遺傳、應激過程等多個方面發(fā)揮抗RA的作用。

痹癥寧方的KEGG通路除了富集在類風濕關節(jié)炎通路上，與脂質代謝、動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產物-受體(AGE-RAGE)信號通路、非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、炎癥性腸病、致病性大腸桿菌感染、Th17細胞分化、TNF、IL-17、NF-κB信號通路、EB病毒、皰疹病毒感染等通路密切相關。其中，脂質代謝和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE及TNF信號通路上聚集基因最多。不平衡的脂質代謝在自身免疫反應中具有致病作用，不僅是動脈粥樣硬化形成的基礎，更是RA的危險因素[18]。AGEs的積累和RAGE的激活誘導了血管組織中持續(xù)的氧化應激，抑制AGE/RAGE信號通路可以減輕血管內皮的氧化應激從而保護血管[19]。有研究表明RA中心血管合并癥、2型糖尿病、高血脂癥、腸道菌群失調及細菌易位等共病與RA疾病活動具有相關性，且某些共病與RA有因果關系[13]。TNF-α可以激活RA-FLSs的自噬及NF-κB信號通路，當自噬被阻斷時，FLSs的自噬水平明顯降低，TNF-α誘導的增殖/凋亡失衡被逆轉[20]。TNF-α可刺激致病性Th17細胞的分化并產生IL17、GM-CSF，擴大炎癥反應，但TNF-α和IL-17/Th17通路在RA發(fā)病機制中并不完全融合，IL-17/Th17通路仍為RA的非冗余治療目標[21]。因此，痹癥寧方能摒棄西藥治療疾病單一或加重某些共病的缺點，對于RA合并脂質代謝紊亂、動脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥、乙型肝炎、非酒精性脂肪肝、炎癥性腸病等共病的治療具有天然優(yōu)勢。

痹癥寧方抗RA的關鍵基因分別為IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，主要參與的生物學過程有正向調節(jié)血管生成和發(fā)育、細胞及白細胞趨化性、神經炎癥反應、平滑肌細胞增殖的正調控、對脂多糖及細菌源分子的反應等，并且經過分子對接技術考證，提示痹癥寧方與關鍵基因有較好的聚合活性。IL6在RA中先天免疫和適應性免疫都至關重要，IL6產生失調導致持續(xù)性炎癥，且抗IL6藥物是RA較好的候選藥物[22]。IL1B的遺傳變異與RA易感性相關，ACPA陽性RA患者中IL1B水平升高，ACPAs可以促進巨噬細胞產生IL1B[23-24]。已有研究證實RA滑膜液中IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1濃度較高，可能通過細胞因子-細胞因子受體相互作用和IL-17信號通路介導RA中性粒細胞自噬[25]。VEGFA是新生血管形成的啟動因子，新生血管在RA發(fā)病機制中促進炎癥細胞的入侵和局部疼痛受體的增加，從而導致結構損傷和疼痛[26]。RA滑膜成纖維細胞介導PTGS2信號上調單核細胞中TREM-1的表達，增加單核細胞的炎癥反應微環(huán)境[27]。JUN可直接激活促炎因子環(huán)氧合酶-2，間接抑制抗炎因子精氨酸酶-1，調節(jié)巨噬細胞的活化狀態(tài)，促進關節(jié)炎的發(fā)生[28]。血管的生成和增殖不僅為滑膜的生長提供了更多的營養(yǎng)，而且為細胞因子和炎癥細胞提供了擴散通道，阻斷血管生成可以抑制滑膜炎癥和血管翳的形成[29]。神經炎癥顯著促進從急性疼痛到慢性疼痛的過渡以及神經病變疼痛的永久化，主要病理為血管通透性改變、白細胞聚集及釋放炎癥介質、激活中樞神經系統(tǒng)的小膠質及星形膠質細胞，加重炎癥性疼痛及慢性疼痛的中樞敏感化，RA的持續(xù)性慢性關節(jié)痛與此密切相關[30-31]?？傊园Y寧方的主要作用靶點有IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，參與血管的生長發(fā)育、炎癥的觸發(fā)、形成及神經炎癥等生物學過程，著重于延緩關節(jié)局部結構損傷和慢性疼痛。

綜上所述，痹癥寧方可能通過調節(jié)血液微生物環(huán)境、炎癥反應、局部氧供及代謝、表觀遺傳、應激過程等多個方面發(fā)揮抗RA的作用；主要候選靶點有IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，著重于延緩關節(jié)局部結構損傷和慢性疼痛；并對于脂質代謝紊亂、動脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥、炎癥性腸病等共病的治療有優(yōu)勢。本研究拓展了痹癥寧方新的作用機制，但也需要進一步基礎實驗驗證，可以為后續(xù)的課題研究提供新的方向和思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。