陶 莎，張效平，商寶娣，李小義，姚俊杰

( 1.貴州省農業(yè)科學院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省特種水產(chǎn)工程技術中心，貴州 貴陽 550025 )

目前，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細菌疾病的治療中，抗生素藥品仍為治療首選，但長期使用易導致病原菌出現(xiàn)耐藥性和藥物殘留問題[4]。中草藥含有豐富的生物活性物質和營養(yǎng)成分，既可提高消化酶活性，促進營養(yǎng)物質消化吸收，進而提高水產(chǎn)動物生長性能，又可提高水產(chǎn)動物非特異性免疫功能，增強其抗菌、抗病能力；中草藥還具有毒副作用小、無殘留等優(yōu)點[5-7]。筆者采用水煎法獲得41種中草藥的提取物，測定41種中草藥提取物及其復方

對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，篩選出能有效抑制嗜水氣單胞菌的中草藥及復方，為養(yǎng)殖斑點叉尾因嗜水氣單胞菌感染引起疾病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

41種中草藥為：金銀花、夏枯草、石榴皮、大黃、訶子、敗醬草、熟地黃、地榆、黃苓、杜仲、黃柏、紫花地丁、大青葉、蘇木、枸杞、丹參、柴胡、板藍根、厚樸、穿心蓮、黃連、五倍子、石菖蒲、青皮、連翹、烏梅、高良姜、肉桂、苦參、茯苓、地膚子、牡丹皮、陳皮、蛇床子、姜黃、豬苓、黃芪、藿香、公丁香、小茴香、昆布。均購自本地中藥房。

MH營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)肉湯為自行配制，96孔板、牛津杯及其他試驗耗材購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌株液制備

1.2.2 中草藥提取物制備

50 g中草藥置于1000 mL雙蒸水中浸泡1 h后，大火煮沸轉小火熬制2 h，三層紗布過濾藥液，剩余藥渣再加入1000 mL雙蒸水浸泡1 h，重復第一次熬制過程，合并兩次藥液，小火加熱濃縮至50 mL，使藥液終質量濃度為1 g/mL(即1000 mg/mL)，121 ℃滅菌20 min，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中草藥抑菌圈測定

采取瓊脂平板打孔法測定抑菌圈大小。滅菌培養(yǎng)皿中一次性倒入約10 mL滅菌LB液，待底層凝固后，均勻放置4個滅菌的牛津杯，倒入LB營養(yǎng)瓊脂10～15 mL，待凝固后，用無菌棉棒蘸取密度為1×107cfu/mL的菌液500 μL，均勻涂抹在牛津杯以外的培養(yǎng)面上，待菌液完全吸收后，用鑷子小心取出牛津杯，往孔中加入80 μL制備好的中草藥提取物，每個平板中3個平行，第4個孔加入80 μL滅菌水作對照，28 ℃正置培養(yǎng)24 h后取出測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑(d)評定標準參照文獻[1]：d≥20 mm 為極敏(S++)，20 mm>d≥15 mm為高敏(S+)，15 mm>d≥10 mm 為中敏(S)，d<10 mm為低敏(S-)。

1.2.4 最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度的測定

最小抑菌質量濃度(MIC)：采用96孔板微量肉湯稀釋法測定。無菌條件下，取干凈96孔酶標板(12×8)，每孔加入滅菌MH肉湯100 μL。第1～3列第1行加入制備好的中草藥提取物100 μL，充分混勻后，逐次倍比稀釋至第11列(每孔液體終體積100 μL，最后一列稀釋完后吸出100 μL)，使1～11列提取物質量濃度分別為500 mg/mL(2倍稀釋)、250 mg/mL(4倍稀釋)、125 mg/mL(8倍稀釋)、62.5 mg/mL(16倍稀釋)、31.25 mg/mL(32倍稀釋)、15.63 mg/mL(64倍稀釋)、7.81 mg/mL(128倍稀釋)、3.91 mg/mL(256倍稀釋)、1.95 mg/mL(512倍稀釋)、0.98 mg/mL(1024倍稀釋)、0.49 mg/mL(2048倍稀釋)；1～3行的1～11孔加入稀釋過的菌懸液10 μL，第12孔不加入菌液，做陰性對照，第4行的1～11孔不加入菌液，作為對照查看是否生長細菌，第12孔加入100 μL菌液，做陽性對照，一板一藥，28 ℃正置培養(yǎng)24 h后，取出觀察結果，前3行與第4行透明度相似的質量濃度即為最小抑菌質量濃度。

最小殺菌質量濃度(MBC)：選擇高于最小抑菌質量濃度的質量濃度組，用無菌棉棒蘸取孔中的液體，均勻涂于培養(yǎng)皿中，28 ℃倒置培養(yǎng)18 h后取出觀察結果，少于5個單菌落試驗組的質量濃度即為該藥的最小殺菌質量濃度。

1.2.5 藥物聯(lián)用試驗

根據(jù)上述試驗結果得出效果較好的單方中草藥，將選出的中草藥進行兩兩聯(lián)合試驗。試驗分為兩部分：聯(lián)用藥物對抑菌圈的影響和聯(lián)用藥物最小抑菌質量濃度與最小殺菌質量濃度的測定，根據(jù)結果綜合分析聯(lián)用效果，為下一步篩選復方中草藥提供依據(jù)。

聯(lián)用抑菌圈效果：培養(yǎng)基的制備類似牛津杯打孔培養(yǎng)基，區(qū)別是將兩個孔之間的距離縮短約5 mm，兩孔中分別加入不同的單方中草藥提取物A與提取物B各80 μL，其余操作同1.2.3，中草藥兩兩結合，正置培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察兩抑菌圈交會處，判斷其聯(lián)用效果。聯(lián)用效果包括協(xié)同作用(++)、相加作用(+)、無相關作用(-)和拮抗作用(--)。

聯(lián)用最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度的測定采用棋盤交叉法。將篩選出的抑菌效果較好的單方中草藥進行兩兩聯(lián)合抑菌試驗，以2MIC的質量濃度為初始質量濃度，用滅菌MH營養(yǎng)肉湯進行2倍稀釋，配制每種藥的質量濃度梯度為：2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC，配制完成的2種單方中草藥按照表1進行混合，各加入500 μL，然后在每孔中加入1%紅四氮唑溶液5 μL，檢驗細菌是否生長(紅四氮唑檢驗原理：細菌生長過程伴隨著糖類脫氫，紅四氮唑與氫結合發(fā)生反應，使培養(yǎng)基發(fā)紅)。聯(lián)合抑菌試驗以部分抑菌指數(shù)(FIC)作為判定依據(jù)，部分抑菌指數(shù)計算方法如下：

表1 棋盤交叉法圖示Tab.1 The graphical representation of board cross

FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5

1.2.6 復方配制方法

采用正交試驗設計中草藥復方配制。根據(jù)上述試驗結果，得出6種抑菌效果較好的單方中草藥(石榴皮、訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅)，以6種中草藥作為6種因素進行復方配制，根據(jù)正交表L25(56)設計出25組復方，分別為M-1、M-2、M-3……M-24、M-25，每組的終體積為1000 μL，各因素質量按照表2所示比例進行配制。復方的抑菌圈、最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度測定參照1.2.3和1.2.4進行。

表2 中草藥復方體積配比Tab.2 Preparation tables of mixed Chinese herbal medicine by volume ratio

2 結 果

2.1 單方中草藥體外抑菌結果

41種單方中草藥的抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度結果見表3。有抑菌圈的中草藥有14種，其中訶子、黃柏、蘇木、黃連、連翹、烏梅的抑菌圈直徑均超過20 mm，抑菌效果為極敏。綜合抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度結果可知，石榴皮、訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅6種單方中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果較好。其中黃連的綜合抑菌效果最好，其抑菌圈直徑達23 mm，最小抑菌質量濃度為7.81 mg/mL。

表3 單方中草藥的體外抑菌結果 mg/mLTab.3 In vitro bacteriostatic results of single Chinese herbal medicine

2.2 藥物聯(lián)合體外抑菌結果

將篩選出的抑菌效果較好的6味單方中草藥進行15組兩兩聯(lián)合試驗，結果顯示：15組聯(lián)合藥敏試驗中，石榴皮+訶子、石榴皮+蘇木等7組表現(xiàn)為協(xié)同作用，石榴皮+黃連、石榴皮+烏梅等6組表現(xiàn)為相加作用；石榴皮+黃連及訶子+黃連2組表現(xiàn)為不相關作用(表4)。進行聯(lián)合抑菌試驗時，部分抑菌指數(shù)最低為訶子+蘇木組的0.31，部分抑菌指數(shù)最高為訶子+紫花地丁組的2.06；未拮抗的比例為93.3%，聯(lián)用效果較好(即部分抑菌指數(shù)≤1)的比例為80%，說明篩選出的6種單方中草藥具有較好的抑菌作用(表4)。

表4 藥物聯(lián)合的體外抑菌結果Tab.4 In vitro bacteriostatic results of Combined Chinese herbal medicines

2.3 復方中草藥體外抑菌結果

按照表2配制成25組復方中草藥，對其抑菌圈、最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度進行測定，試驗結果見表5。抑菌圈表現(xiàn)為極敏的比例為60%、高敏為40%；最小抑菌質量濃度除M-9組為7.81 mg/mL外，其余試驗組均穩(wěn)定在15.63～31.25 mg/mL；最小殺菌質量濃度不超過62.50 mg/mL的比例為84%。綜合抑菌圈直徑、最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度數(shù)據(jù)，結合聯(lián)合用藥結果可知，M-10復方組的綜合效果最好，即V(石榴皮)∶V(訶子)∶V(紫花地丁)∶V(蘇木)∶V(黃連)∶V(烏梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4，石榴皮、訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅使用質量濃度較單一使用各降低了80.24%、70.60%、94.11%、80.24%、82.33%、76.44%。

表5 復方中草藥的體外抑菌結果Tab.5 In vitro bacteriostatic results of mixed Chinese herbal medicines

3 討 論

3.1 單方中草藥的體外抑殺效果

近年來，抗生素的濫用導致多重耐藥菌株的出現(xiàn)與流行[8]，抗生素在水體中及水產(chǎn)動物體內殘留情況也比較嚴重，不僅對環(huán)境造成很大污染，也危害著人類的健康[9]。研究表明，中草藥特殊的抗病原微生物機制使其不易產(chǎn)生耐藥性，其可通過調動機體內的積極因素來減弱細菌對組織的破壞以及降低細菌毒力等方式發(fā)揮抑菌作用[10]。

本試驗結果顯示，石榴皮、訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅6種單方中草藥對嗜水氣單胞菌的綜合體外抑菌效果較好，其中黃連的效果最好，最小抑菌質量濃度為7.81 mg/mL。王洪彬等[1,11-13]研究顯示，訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅5種單方中草藥對嗜水氣單胞菌有較好的抑菌效果，與本試驗結果相符，說明訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅對嗜水氣單胞菌的抑菌效果存在一定的普遍性。本試驗結果還顯示，石榴皮對嗜水氣單胞菌具有較好的體外抑殺效果，與夏與晴等[12-14]試驗結果一致。王洪彬等[1]研究顯示，石榴皮對嗜水氣單胞菌的抑菌效果較差，與本試驗結果不一致，這可能是由單方中草藥提取方法差異所致：王洪彬等[1]的提取方法為對中草藥清洗、烘干后粉碎再水煎提取有效成分；而本試驗與夏與晴等[12-14]的試驗中，并未對中草藥進行上述步驟，只是將烘干的中草藥直接進行水煎提取。提取工藝條件的不同，中藥活性物質溶出就會發(fā)生質量變化，并影響抗菌作用，而隨著提取方法的改變，不同方法提取的同種單方中草藥抑菌效果可能也會改變[15]。

3.2 中草藥體外抑菌效果差異

連翹、烏梅、高良姜3種單方中草藥體外抑殺結果顯示：連翹與烏梅的抑菌圈效果均為極敏(S++)，但連翹的最小抑菌質量濃度為62.50 mg/mL，而烏梅為15.63 mg/mL，僅為連翹質量濃度的1/4；烏梅與高良姜的最小抑菌質量濃度均為15.63 mg/mL，但高良姜的抑菌圈直徑為12 mm，僅為烏梅的1/2。這說明不同中草藥可能對同一種細菌存在抑殺效果，但藥效上有一定差異，可能與細菌抵抗不同藥物的抗性機制有關。

還有研究顯示：天南星對蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)存在較強的抑制作用，對熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的抑制作用較弱，對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)及弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)沒有抑制作用[12]；黃連、魚腥草、五味子、艾草等對大腸桿菌(Escherichiacoli)具有較好的抑制作用，而黃芩和連翹則對大腸桿菌抑制效果較差[16]。本試驗結果顯示，黃連、連翹對嗜水氣單胞菌具有較強的抑制作用，說明同種中草藥對不同的細菌抑殺效果存在差異。這可能與不同中草藥所含有的活性物質不同有關，比如：黃連中含有5.56%～7.25%的小檗堿，還含有黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿等生物堿，小檗堿對多種革蘭氏陽性及陰性菌均具有抑制作用，所以黃連對嗜水氣單胞菌及大腸桿菌均具有抑制作用；連翹中具有連翹酯苷A、連翹酯苷B、連翹苷、連翹素等活性抑菌物質，但不同地區(qū)生長的連翹對大腸桿菌的抑制效果存在差別[17]，這可能導致不同的研究中連翹對細菌的抑制效果不同。

3.3 復方中草藥體外抑殺效果

通常，中草藥具有抑菌作用的成分主要包括有機酸類、生物堿類、黃酮類、萜類、醌類以及其他成分種類[11]，利用不同藥物間的協(xié)同作用，將兩種或兩種以上的藥物進行配伍，使其共同作用于致病菌，對水產(chǎn)動物整體治療有良好效果[18]，將抑菌效果不同的中草藥組合成具有協(xié)同作用的復方制劑可發(fā)揮更好的抑菌作用[19]。筆者利用正交試驗設計研究6種抑菌效果較好的單方中草藥進行復方配伍后的抑菌效果，正交試驗設計是獲得最佳搭配的方法之一，其原理為綜合比較，即在同因素中將相同水平的結果相加，找出每個因素的最好水平，得到最佳搭配。

根據(jù)中獸醫(yī)學理論和中草藥藥理性質將多種單味中草藥組合成復方中草藥，可以減小各種藥物的毒性，提高藥效[20]。本試驗結果表明，復方配伍綜合抑殺嗜水氣單胞菌效果最好的比例為：V(石榴皮)∶V(訶子)∶V(紫花地丁)∶V(蘇木)∶V(黃連)∶V(烏梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4，各種中草藥的使用質量濃度比單方平均降低了80.66%，但綜合抑菌效果要優(yōu)于單方中草藥，可能是因為相互之間的配合將中草藥的抑菌物質活性提高。

4 結 論

綜上所述，石榴皮、訶子、紫花地丁、蘇木、黃連、烏梅6種單方中草藥對嗜水氣單胞菌的綜合體外抑菌效果較好。單一中草藥抑菌效果比較多變、不穩(wěn)定，復方中草藥比單一中草藥整體抑菌效果較好且穩(wěn)定。復方配伍綜合抑殺嗜水氣單胞菌效果最好的比例為：V(石榴皮)∶V(訶子)∶V(紫花地丁)∶V(蘇木)∶V(黃連)∶V(烏梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4。本研究結果可為中草藥在斑點叉尾養(yǎng)殖中的細菌病防控提供理論依據(jù)。