馮付靄，趙 震，陶 妍,2，謝 晶,2，錢韻芳,2

( 1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306 )

溶菌酶在大多數(shù)生物先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其主要包括植物、動(dòng)物和微生物來源的溶菌酶[1]；而動(dòng)物來源的溶菌酶則可分為雞型(C型)、鵝型(G型)和無脊椎動(dòng)物型(I型)，其中研究最多、最具代表性的是C型，即雞蛋清中的天然C型溶菌酶。水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶的研究起步較晚，但因其特殊的作用機(jī)理及其在動(dòng)物免疫中的重要作用而越來越受到關(guān)注[2]。魚類等脊椎動(dòng)物中僅存在C、G型溶菌酶，而貝類等無脊椎動(dòng)物中3種類型溶菌酶均存在[3]。三者之間在一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在較大差異，C型溶菌酶含保守的8個(gè)半胱氨酸殘基，魚類G型溶菌酶大多數(shù)缺乏半胱氨酸殘基；而I型溶菌酶含多至14個(gè)的半胱氨酸殘基，以致在空間上可形成7對(duì)二硫鍵而賦予其結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性[4-5]。自1975年Jollès等[6]從海星Asteriasrubens中分離出第一個(gè)I型溶菌酶以來，已從斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[7]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[8]、青蛤(Cyclinasinensis)[9]、剃刀蛤(Sinonovaculaconstricta)[10]和文昌魚(Branchiostomajaponicum)[3]等無脊椎動(dòng)物中克隆到I型溶菌酶基因。

曾有學(xué)者對(duì)文昌魚施行鰻弧菌(Vibrioanguillarum)挑戰(zhàn)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其鰓中C型和G型溶菌酶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平并無明顯變化，但I(xiàn)型溶菌酶的轉(zhuǎn)錄水平在24 h后明顯提高[3]；有研究顯示，將菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)置于人為設(shè)置的鰻弧菌污染的養(yǎng)殖環(huán)境中，其I型溶菌酶基因在血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高[11]；此外，當(dāng)剃刀蛤在有副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，其鰓和肝胰腺中I型溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加[10]。由此可以確定I型溶菌酶是無脊椎動(dòng)物的重要蛋白質(zhì)免疫因子，因此其可以成為開發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。曾有學(xué)者構(gòu)建了剃刀蛤和仿刺參的I型溶菌酶的原核表達(dá)系統(tǒng)，最初獲得的是無活性的表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行基于尿素透析的復(fù)性處理后才使其顯示部分活性[10,12]；另有學(xué)者通過巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)獲得克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的重組I型溶菌酶，其顯示了抗多種細(xì)菌的生物學(xué)活性[13]。

青蛤是我國(guó)沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，其作為濾食性的水產(chǎn)生物，具有較強(qiáng)的抗逆能力。研究表明，在有鰻弧菌的養(yǎng)殖環(huán)境中生長(zhǎng)的青蛤，其體內(nèi)的某些溶菌酶的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)明顯提高[9]。對(duì)其C型溶菌酶基因進(jìn)行了cDNA克隆及基于重組畢赤酵母的生物合成研究，發(fā)現(xiàn)重組C型溶菌酶具有良好的抑菌活性和穩(wěn)定性[14]。然而，關(guān)于青蛤I型溶菌酶的重組表達(dá)方面的研究尚未見報(bào)道。據(jù)此，筆者擬通過構(gòu)建重組畢赤酵母菌株，實(shí)現(xiàn)青蛤I型溶菌酶的分泌表達(dá)，旨在為無脊椎動(dòng)物來源I型溶菌酶的制備提供重組DNA技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、載體和菌株

青蛤來源于上海市魚港路海鮮市場(chǎng)；pMD-19T來源于日本TaKaRa公司；pPICZαA和畢赤酵母X-33來源于美國(guó)Invitrogen公司(pPICZαA屬穿梭載體，它含眾多限制性酶切位點(diǎn)以便于目的基因與其連接構(gòu)建重組載體；此外，它含有強(qiáng)誘導(dǎo)型醇氧化酶啟動(dòng)子5′AOX1和分泌信號(hào)肽α-factor，前者可以利用甲醇表達(dá)任何外源基因，而后者能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的持續(xù)分泌表達(dá))；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α來源于北京天根生物科技有限公司；試驗(yàn)細(xì)菌為副溶血性弧菌(ATCC17802)、大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)。

1.1.2 主要試劑

RNAiso plus、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶和3種核酸內(nèi)切酶(Xba Ⅰ、Xho Ⅰ、Sac Ⅰ)來源于日本TaKaRa公司；Fastking cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、膠上DNA和酵母基因組DNA以及質(zhì)粒提取的試劑盒來源于北京天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)來源于北京中科瑞泰生物科技有限公司；Western Blot試劑盒來源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。DNA測(cè)序和PCR引物的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。用于培養(yǎng)細(xì)菌和畢赤酵母的所有培養(yǎng)基配方(LB、YPD、MM、MD、BMGY、BMMY)見畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增青蛤I型溶菌酶基因

新鮮青蛤采購(gòu)后快速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即取其閉殼肌，按RNAiso Plus說明書提取總RNA。第1鏈cDNA的合成：2 μL總RNA、1 μL 3′ RACE Adaptor primer (5 μmol/L)、2 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL dNTPs Mixture (10 mmol/L each)、0.25 μL RNase Inhibitor (40 U/μL)、0.25 μL Prime Script RTase (200 U/μL)、3.5 μL RNase-Free dH2O；先42 ℃ 60 min，再70 ℃ 15 min。

參考青蛤I型溶菌酶基因序列(GenBank登錄號(hào)：HQ651175)設(shè)計(jì)引物(表1)。以第1鏈 cDNA 為模板、F1和 R1為引物，通過PCR擴(kuò)增編碼青蛤I型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA。PCR體系：1 μL 10×Taq Buffer、0.8 μL dNTPs(2.5 μmol/L each)、各 0.2 μL 的F1和R1(10 μmol/L)、0.1 μL第1鏈 cDNA、0.1 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)，調(diào)至總量10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。以pMD-19T為克隆載體，將第1次PCR產(chǎn)物與其連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑取白色菌落用于陽(yáng)性克隆的篩選，入選的陽(yáng)性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。在此基礎(chǔ)上再分別以2對(duì)引物(F2、R2和F2、R3)(表1)進(jìn)行第2次和第3次PCR，以在5′端(Xho Ⅰ位點(diǎn)、Kex 2信號(hào)肽酶切位點(diǎn))和3′端(6×His標(biāo)簽、終止密碼子、Xba Ⅰ位點(diǎn))添加相關(guān)位點(diǎn)，反應(yīng)體系和程序同第1次PCR，退火溫度分別改為58.6 ℃和58.4 ℃。最終獲得的目的片段同上經(jīng)DNA測(cè)序后命名為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因。經(jīng)ExPASy軟件(http：//web.expasy.org/compute.pi/)預(yù)測(cè)CslyI的分子質(zhì)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2 pPICZαA-CslyI和X-33/pPICZαA-CslyI的構(gòu)建

pMD-19T-CslyI經(jīng)Xba Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后獲得目的片段CslyI，按試劑盒說明書將其與pPICZαA連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI(圖1)，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞后經(jīng)增殖培養(yǎng)、按照快速小提質(zhì)粒試劑盒說明書提取純化重組載體pPICZαA-CslyI，通過雙酶切、菌落PCR和DNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行確證。雙酶切反應(yīng)體系：70 μL重組載體、10 μL 10×M Buffer、10 μL 0.1% BSA、5 μL Xho Ⅰ(15 U/μL)、4 μL Xba Ⅰ(10 U/μL)，37 ℃反應(yīng)8 h。

圖1 重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-CslyI

使用Sac Ⅰ對(duì)pPICZαA-CslyI進(jìn)行線性化酶切后，將其與畢赤酵母X-33按1∶8(體積比)混合，置于電轉(zhuǎn)杯中冰浴數(shù)分鐘后電擊5 ms (1.5 kV、25 μF、200 Ω)；加入1 mol/L的山梨醇1 mL，約1.5 h后加入YPD培養(yǎng)基1 mL于搖床培養(yǎng)1.5 h；菌體涂于含100 μg/mL博萊霉素YPD平板，于29 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑選長(zhǎng)勢(shì)飽滿的酵母單菌落再依次接種至含1000 μg/mL博萊霉素MM、MD、YPD平板，經(jīng)培養(yǎng)后篩選優(yōu)質(zhì)的X-33/pPICZαA-CslyI酵母轉(zhuǎn)化子，并使用5′AOX 1和3′AOX 1(表1)對(duì)其基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。另外，同上方法構(gòu)建X-33/pPICZαA酵母轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照。

1.2.3 重組青蛤I型溶菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

于5 mL的YPD培養(yǎng)基中接種入優(yōu)質(zhì)的酵母轉(zhuǎn)化子后，28 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16 h；轉(zhuǎn)接250 μL于50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)48 h；菌體重懸于250 mL的BMMY培養(yǎng)基(含1%甲醇)中，再培養(yǎng)72 h。通過Tricine-SDS-PAGE分析離心后的培養(yǎng)液上清[4%濃縮膠、18%分離膠、9%三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]。

Western blot分析按試劑盒說明書進(jìn)行：凝膠上的蛋白質(zhì)條帶被電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜后，加入封閉液8 mL反應(yīng)1 h；用1×TBST兩次洗膜后再分別與鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠單克隆抗體反應(yīng)2 h和1 h；經(jīng)洗膜后使用HRP-DAB試劑盒對(duì)其顯色。由上海中科新生命生物科技有限公司對(duì)經(jīng)鎳離子親和層析純化后的重組蛋白進(jìn)行基于MALDI-TOF-TOF的序列分析。

1.2.4 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性及穩(wěn)定性測(cè)定

將培養(yǎng)至600 nm吸光值[D(600 nm)]為0.5的副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋100倍后，按1∶100(體積比)與X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液于37 ℃作用2 h；然后取30 μL涂于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出。以X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液作為陰性對(duì)照。

另一方面，將40 μL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別注入96孔板中，加入經(jīng)100 ℃沸水浴保溫0、20、40、60 min的80 μL培養(yǎng)液上清液，于37 ℃孵育過夜后使用酶標(biāo)儀(BioTeK?，美國(guó))測(cè)定D(600 nm)，以考察經(jīng)高溫處理不同時(shí)間后的培養(yǎng)液上清液對(duì)細(xì)菌的抑制作用[15]。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)平行，使用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因的cDNA克隆

經(jīng)過3次PCR依次擴(kuò)增到590、516、528 bp的cDNA片段，最后的PCR產(chǎn)物為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因(圖2)，其DNA測(cè)序結(jié)果見圖3，Xho Ⅰ和Xba Ⅰ 2個(gè)限制性位點(diǎn)、Kex 2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽均被添加。除去這些位點(diǎn)，CslyI基因編碼了由162個(gè)氨基酸殘基組成的青蛤I型溶菌酶成熟肽，含有的14個(gè)保守半胱氨酸殘基可以在空間上形成7對(duì)二硫鍵以穩(wěn)定其空間結(jié)構(gòu)。經(jīng)分析，CslyI的理論分子質(zhì)量為19.97 ku，等電點(diǎn)為7.6。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR productsM.DNA標(biāo)記；1.第1次PCR擴(kuò)增片段；2.第2次PCR擴(kuò)增片段；3.第3次PCR擴(kuò)增片段.M.DNA marker;1.the first PCR amplification fragment;2.the second PCR amplification fragment;3.the third PCR amplification fragment.

圖3 目的基因CslyI的核苷酸及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the target gene CslyI斜體指示Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)；下劃線指示Kex 2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)；陰影指示半胱氨酸殘基.Italics indicate Xho Ⅰ and Xba Ⅰ restriction sites;underline indicates Kex 2 signal cleavage site;cysteine residues are shaded.

2.2 pPICZαA-CslyI的鑒定及其X-33/pPICZαA-CslyI的篩選

以DH5α/pPICZαA-CslyI為模板，使用引物5′AOX1和3′AOX1對(duì)重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增到1個(gè)約1000 bp的片段，與1030 bp的理論值相符(圖4a)。另一方面，使用Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ對(duì)pPICZαA-CslyI進(jìn)行雙酶切后顯示，在略高于500 bp處有淡淡的條帶，與預(yù)期的528 bp相符(圖4b)。最終通過DNA測(cè)序證明目的基因CslyI已正確連接至pPICZαA表達(dá)載體。通過含1000 μg/mL博萊霉素的YPD平板篩選到5株高拷貝的X-33/pPICZαA-CslyI重組菌株，對(duì)它們的基因組DNA的驗(yàn)證結(jié)果顯示，5株重組酵母菌均擴(kuò)增到約1000 bp的片段(圖4c)，與預(yù)期的1030 bp相符。

圖4 pPICZαA-CslyI的菌落PCR(a)和雙酶切驗(yàn)證(b)及X-33/pPICZαA-CslyI的篩選(c)Fig.4 Identification of pPICZαA-CslyI by colony PCR (a) and digestion of two endonucleases (b) as well as screening of X-33/pPICZαA-CslyI (c)M.DNA標(biāo)記；1.PCR產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物；3～7.含pPICZαA-CslyI的酵母轉(zhuǎn)化子；8.含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子.M.DNA marker;lane 1.PCR product;lane 2.pPICZαA-CslyI products digested by two endonucleases;lanes 3～7.yeast transformants containing pPICZαA-CslyI;lane 8.yeast transformant containing pPICZαA.

2.3 在畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白

選擇6號(hào)菌株用于重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5a)：培養(yǎng)液上清液在靠近22.0 ku 處存在明顯條帶，基本接近重組蛋白的理論分子質(zhì)量19.97 ku，初步推測(cè)其為目的蛋白；其條帶位置偏上可能與待分析蛋白質(zhì)樣品變性不完全有關(guān)[16]，以下試驗(yàn)結(jié)果將進(jìn)一步證明此判斷。

圖5 重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE(a)和Western blot(b)分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE (a) and Western blot (b) analysis for the recombinant strain productsM1.超低蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.彩虹預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清液；2.含pPICZαA-CslyI的酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清液.M1.ultra-low protein molecular weight marker;M2:rainbow pre-stained protein molecular weight marker;lane 1.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA;lane 2.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA-CslyI.

2.4 基于Western blot和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜的表達(dá)產(chǎn)物鑒定

通過Western blot對(duì)X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液進(jìn)行分析，其為1個(gè)近25 ku的單一明顯雜交條帶，其分子質(zhì)量明顯高于理論分子質(zhì)量 19.97 ku(圖5b)，分析原因可能與使用的彩虹預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，即目的蛋白與顯色染料共價(jià)偶聯(lián)后，減慢了其在凝膠中的遷移速度，以致顯示的分子量變大，此現(xiàn)象在筆者之前的研究中也有出現(xiàn)。而X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液未出現(xiàn)任何雜交條帶。進(jìn)一步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在m/z1441.8～2727.4 之間捕獲到2個(gè)肽段：m/z為1499.7352的峰代表自N端起第143～155的肽段(GCKSGSTIGYWQR)(圖6)、m/z為2251.0564的峰代表自N端起第67～85的肽段(NVGCKMDIGSYSCGYFQIK)。兩者與推斷的氨基酸理論序列完全一致，證明了表達(dá)產(chǎn)物即為預(yù)期的重組青蛤I型溶菌酶。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析Fig.6 MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis of the expressed products大寫字母指示氨基酸序列.Capital letters indicate amino acid sequences.

2.5 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性和穩(wěn)定性

基于平板涂布法的抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，菌株X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌作用后，菌落數(shù)明顯少于陰性對(duì)照(X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液與細(xì)菌作用)(圖7)。另一方面，為了考察重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性，將培養(yǎng)液上清液置于沸水浴中保溫不同時(shí)間后與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用，保溫20、40、60 min后的培養(yǎng)液上清液仍然對(duì)上述2種細(xì)菌具有抑菌活性(圖8)，與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，表明青蛤I型溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖7 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of the recombinant protein CslyIin clam C. sinensis1.用X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液處理的細(xì)菌；2.用X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液處理的細(xì)菌.1.bacteria treated with X-33/pPICZαA culture supernatant;2.bacteria treated with X-33/pPICZαA-CslyI culture supernatant.

圖8 高溫處理對(duì)重組青蛤I型溶菌酶抑菌活性的影響Fig.8 Effect of high temperature on the antibacterial activity of recombinant CslyI in clam C. sinensis

3 討 論

3.1 影響重組青蛤I型溶菌酶表達(dá)量的因素

通過構(gòu)建青蛤I型溶菌酶的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，首次獲得具有抑菌活性的重組青蛤I型溶菌酶，但表達(dá)量很低?？赡苡?個(gè)原因：(1)菌體接種量偏低。本次試驗(yàn)使用的培養(yǎng)基含酵母浸出物和優(yōu)質(zhì)蛋白胨，它較以前使用的無氨基氮源培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，更有利于菌體生長(zhǎng)，故嘗試將菌體接種量減為0.5%；但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，減少接種量會(huì)影響重組青蛤I型溶菌酶的表達(dá)量。有研究表明，菌體接種量為2%～10%，隨著接種量的增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量會(huì)隨之增加[17]。(2)根據(jù)Graphical Codon Usage Analyser(http://www.gcua.schoedl.de)預(yù)測(cè)，筆者通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆的青蛤I型溶菌酶cDNA中存在19個(gè)對(duì)于畢赤酵母來說的低頻密碼子，該現(xiàn)象可能會(huì)影響重組蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。有學(xué)者報(bào)道，其根據(jù)畢赤酵母的密碼子喜好優(yōu)化了納豆激酶成熟肽的基因nkD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用合成的優(yōu)化基因后使重組納豆激酶成熟肽的表達(dá)量提高了3.5倍[18]；另有學(xué)者對(duì)人源溶菌酶基因LYZop進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量提高2.2倍，在牛成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量提高2.44倍[19]。綜上，進(jìn)一步的研究將關(guān)注于菌體的接種量和密碼子的優(yōu)化。

3.2 重組青蛤I型溶菌酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

有研究表明，二硫鍵的作用是疊加的，且引入二硫鍵突變體的蛋白質(zhì)的變性溫度較野生型蛋白質(zhì)高很多[20]。筆者對(duì)重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 ℃處理60 min時(shí)，其抑菌活性較對(duì)照組并無明顯下降，證明重組青蛤I型溶菌酶具有良好的穩(wěn)定性。分析原因可能與其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含多至14個(gè)的半胱氨酸殘基有關(guān)，經(jīng)SWISS MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)初步預(yù)測(cè)，這些半胱氨酸殘基在空間上通過7對(duì)二硫鍵將數(shù)個(gè)α-螺旋與無規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)單元締合在一起，形成緊密的球狀蛋白質(zhì)而極大地穩(wěn)定了重組青蛤I型溶菌酶的結(jié)構(gòu)。也有學(xué)者將海參I型溶菌酶置于85 ℃水浴中保溫50 min，發(fā)現(xiàn)其仍具有80%的相對(duì)酶活性[21]。

3.3 基于重組青蛤I型溶菌酶特性的應(yīng)用展望

就目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和食品安全而論，綠色無抗生素飼料的應(yīng)用必將成為主要的趨勢(shì)，因此，具有良好熱穩(wěn)定性的重組青蛤I型溶菌酶極具開發(fā)和使用價(jià)值。飼料生產(chǎn)中餌料的制作一般須經(jīng)歷原料的粉碎、機(jī)械化處理和顆?；驂簤K等過程[22]，這些過程必然會(huì)伴隨溫度的上升，而熱穩(wěn)定性良好的重組青蛤I型溶菌酶則能夠抵抗高溫的影響，從而成為水產(chǎn)飼料添加劑的極佳候選者。此外，含重組青蛤I型溶菌酶的培養(yǎng)液上清液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌具有良好的抑菌活性，預(yù)示了大規(guī)模制備時(shí)對(duì)培養(yǎng)液上清液無需進(jìn)行純化即可將其作為生產(chǎn)天然抗菌劑的原液，這既簡(jiǎn)化了工業(yè)上的操作流程，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。

4 結(jié) 論

通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得編碼青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因CslyI，并成功構(gòu)建了X-33/pPICZαA-CslyI畢赤酵母重組菌株；該菌株于28 ℃、250 r/min、1%甲醇、72 h的發(fā)酵條件下，成功表達(dá)重組青蛤I型溶菌酶；經(jīng)抑菌試驗(yàn)證明，重組青蛤I型溶菌酶具有明顯的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌的活性，并在高溫下顯示良好的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果可為無脊椎動(dòng)物來源I型溶菌酶的制備提供基于重組畢赤酵母的生物合成技術(shù)。