李 巖，周 燕，雷 駱，蘇 建，樊 威，羅 煜，李俊婷，高 賀，周朝偉

( 1.西南大學 水產(chǎn)學院，重慶 402460；2.中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；3.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院，四川 內(nèi)江 641000 )

體色是脊椎動物最重要的表型特征之一，具有擇偶、物種識別、隱藏、警告等重要的功能[1]。色素沉著失調(diào)會引起體色的變異，其中最典型的表現(xiàn)是皮膚白化，通常被認為是由先天性代謝紊亂所致[2]。目前，公認的導致動物白化的原因主要有兩種：黑色素細胞缺乏和黑色素合成障礙。在魚類上，黑色素細胞合成載有大量黑色素的黑素體，黑素體的發(fā)育涉及到細胞器的轉(zhuǎn)運，經(jīng)過4個不同的階段后，含有黑色素的成熟黑素體被轉(zhuǎn)運到角質(zhì)層，最終使魚體出現(xiàn)不同的體色[3-4]。若生理、環(huán)境或遺傳上的任何改變干擾了動物黑色素細胞發(fā)育與分化或黑色素合成過程中的任一環(huán)節(jié)，均會導致動物白化現(xiàn)象的發(fā)生，但是影響魚類皮膚色素沉著最基本的因素是遺傳[5]。魚類頻繁出現(xiàn)白化現(xiàn)象，如白化的斑馬魚(Daniorerio)[6]、骨頰海鲇(Osteogeneiosusmilitaris)[7]和叉牙鯛(Sarpasalpa)[8]等。然而，大量的研究集中在分離和鑒定與魚類白化性狀相關(guān)的基因方面，分子機制相關(guān)研究較為缺乏，有關(guān)色素沉著相關(guān)基因和其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系仍需要進一步探究。

烏鱧(Channaargus)屬鱸形目鱧屬，俗稱烏魚和黑魚，白烏鱧(C.argusvar.)為烏鱧白化變異種，俗稱白烏魚、白烏棒，主要分布于四川省嘉陵江中下游流域、沱江流域，是我國重要的肉食性經(jīng)濟魚類[9]。與普通烏鱧相比，白烏鱧由于其營養(yǎng)價值高、體色特殊受到了養(yǎng)殖戶及觀賞魚從業(yè)者的關(guān)注。截至目前，烏鱧白化形成的分子機制尚未查明。轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)可廣泛應用于分析生物不同性狀、不同生理狀態(tài)和不同組織中基因表達變化情況，有利于挖掘與特定性狀密切相關(guān)的基因。筆者利用Illumina HiSeq技術(shù)對烏鱧和白烏鱧的體色差異進行研究，探究烏鱧皮膚白化的分子調(diào)控機制，以期對其種質(zhì)資源保護和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

試驗所用白烏鱧、烏鱧均由內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所提供，出苗時間、生長環(huán)境、喂養(yǎng)條件均一致。白烏鱧為烏鱧白化變異種，體色多為灰白色，縱觀背部到腹部，呈現(xiàn)出從青灰色到灰白色逐漸過渡的趨勢(圖1)；烏鱧身體背部較暗，呈黑褐色，腹部色淺，體側(cè)具多角形不規(guī)則深色斑紋(圖1)。隨機挑選健康狀況良好的白烏鱧和烏鱧各3尾，體長(38.00±2.09) cm，體質(zhì)量(513±23.78) g。取3尾白烏鱧的體側(cè)皮膚組織(圖1a)，標記為白烏鱧1、白烏鱧2、白烏鱧3；取3尾烏鱧體側(cè)花色均勻的皮膚組織(圖1b)，標記為烏鱧1、烏鱧2、烏鱧3；共6個組織樣品。將試驗魚用丁香酚麻醉后，快速取下其皮膚組織，置于 1.5 mL無酶EP管，迅速放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃中保存，用于隨后的轉(zhuǎn)錄組測定。另取15尾白烏鱧的體側(cè)皮膚組織和15尾烏鱧體側(cè)花色均勻的皮膚組織，每尾魚取3塊皮膚組織，凍存于-80 ℃，用于隨后的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。

圖1 白烏鱧與烏鱧皮膚采樣部位Fig.1 Skin sampling location of albino northern snakehead C. argus var. and northern snakehead C. argus

1.2 RNA-seq文庫制備及測序

采用動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取總RNA，再通過1%的瓊脂糖凝膠電泳分析28S RNA和18S RNA降解程度以及是否有污染，使用NanoDrop 2000核酸檢測儀(Thermo公司,美國)檢測RNA純度,使用Qubit?2.0 Flurometer (Life Technologies，美國)測定總RNA濃度，用Agilent 2100(安捷倫科技公司，美國)精確檢測RNA的完整性。樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入裂解緩沖液將mRNA打斷成短片段，以這些mRNA為模板，用六堿基隨機引物random hexamers合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase Ⅰ和RNase H，合成二鏈cDNA，用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加poly(A)尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。庫檢合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求集中后進行HiSeq雙端測序，每個樣本測6 Gb數(shù)據(jù)量，稱為原始測序數(shù)據(jù)(Raw reads)，并對其原始測序數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)過濾，去除含adapter和含N比例大于10%的數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條數(shù)據(jù)的50%以上)，得到的數(shù)據(jù)稱為過濾后數(shù)據(jù)(Clean reads)，用于后續(xù)的信息分析。試驗用6個樣品均由武漢菲沙基因信息有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序及分析。

1.3 差異表達基因的組裝篩選、功能注釋和富集分析

以烏鱧的genome為參考基因(http://gigadb.org/dataset/100279)，對高質(zhì)量過濾后數(shù)據(jù)進行注釋。使用FPKM法[10]估算基因表達量，即基因的長度和比對到該基因的次數(shù)。用R語言包DEseq2進行差異分析[11]，以|log2(fold change)|≥2且P≤0.05作為閾值。錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)是通過對差異顯著性P值進行校正得到的。采用公認的Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設(shè)檢驗得到的顯著性P值進行校正，并最終采用錯誤發(fā)現(xiàn)率作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標。利用Hyper-geometric distribution分析法，將差異基因、上調(diào)基因、下調(diào)基因分別進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05，表示差異基因顯著富集。

1.4 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標記分析方法

用軟件Samtools進行去重復(Mark duplicates)[12]和軟件GATK進行局部重比對(Local realignment)、堿基質(zhì)量值校正(Base recalibration)[13]等處理，對烏鱧和白烏鱧共6個樣本進行單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標記檢測，取兩款軟件得到結(jié)果的交集，作為最終的高質(zhì)量突變。隨后，采用SnpEff(4.3p)軟件對各樣本進行單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標記注釋，以獲得單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標記的位置，明確其位于哪個基因/基因間區(qū)，是否為錯義突變等。對單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標記的檢測結(jié)果進行注釋，從而實現(xiàn)DNA水平差異基因挖掘和差異基因功能注釋等。

1.5 定量表達分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，利用qRT-PCR分析，挑選出轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中前10個具有差異表達的基因(干擾素誘導的GTP酶5樣基因、XLOC_000762、NLR家族CARD域基因、嘌呤核苷磷酸化酶樣異結(jié)構(gòu)X1基因、補體C7、角鯊烯單氧酶基因、XLOC_022395、C-C基序趨化因子17樣的基因、唾液酸結(jié)合凝集素、超長鏈?；o酶A合成酶樣的基因)和酪氨酸代謝通路中的4個差異表達基因[酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrp1)基因、CF_GLEAN_10017395、乙醇脫氫酶5(adh5)基因、黑尿酸酶(hgd)基因]進行驗證。使用與轉(zhuǎn)錄組測序同批次的RNA進行反轉(zhuǎn)錄(白烏鱧皮膚組織樣本，n=15；烏鱧皮膚組織樣本，n=15)，cDNA的合成參照PrimerScript?RT reagent Kit (寶生物，中國)試劑盒說明書進行。使用軟件Primer 6設(shè)計引物，以18S RNA和β-actin為內(nèi)參進行qRT-PCR驗證(表1)。使用SYBR?Premix Ex TaqTM (寶生物，中國)熒光定量試劑盒，利用qTOWER 3.0熒光定量Roche Light Cycler 96 (Roche，瑞士)熒光定量儀進行qRT-PCR定量驗證。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。采用2-△△Ct法對目的基因進行相對定量分析；使用SPSS 22軟件進行差異分析，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

表1 qRT-PCR驗證引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR amplification

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計及質(zhì)量評估

利用3個白烏鱧皮膚組織和3個烏鱧皮膚組織，構(gòu)建了6個皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫，得到209 332 480條過濾后數(shù)據(jù)，平均過濾后數(shù)據(jù)為34 888 747，Q20堿基百分比平均為 95.78%，Q30堿基百分比平均為90.19%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比平均為47.31%，比對率平均為58.48%(表2)。本次測序結(jié)果中Q30堿基百分比平均在90%以上，Q20堿基百分比平均在95%以上(表2)。試驗結(jié)果表明，本次測序結(jié)果質(zhì)量較好。此外，為提高本試驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，筆者分析了3個白烏鱧和3個烏鱧皮膚組織之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，白烏鱧和烏鱧皮膚的RNA文庫中3個生物學重復之間的相關(guān)性很高(圖2)。這說明筆者利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)測定獲得的數(shù)據(jù)準確性和可靠性較高，可用于后續(xù)分析。

圖2 6個文庫相關(guān)性分析Fig.2 Clustering figure of correlation analysis of 6 libraries

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計Tab.2 Summary of RNA-seq data assessment

2.2 差異表達基因分析

通過R語言中的edgeR程序，計算得到694個差異表達基因(|log2(fold change)|≥2，P<0.01)，相對于烏鱧，白烏鱧皮膚中有223個表達上調(diào)基因和471個表達下調(diào)基因(圖3)。

圖3 烏鱧與白烏鱧皮膚差異表達基因火山圖(a)和柱形圖(b)Fig.3 Volcano plots (a) and column chart (b) of differentially expressed genes between the albino norther snakehead C. argus var. and norther snakehead C. argus

2.3 差異表達基因功能分析

對694個差異表達基因進行GO功能注釋，共注釋到1241個GO條目上(圖4)，其中：594條注釋到生物過程，包含了細胞進程和代謝過程等；387條注釋到細胞組分，包括細胞器和細胞聯(lián)接等；260條注釋到分子功能，包括信號傳感器活性和轉(zhuǎn)運活性等。注釋的3個一級功能富集最多的GO條目分別為細胞過程(n=97)、膜(n=84)和結(jié)合功能(n=124)。

圖4 差異表達基因的GO富集分析結(jié)果Fig.4 The results of GO functional enrichment of the differentially expressed genes

對白烏鱧上調(diào)差異表達基因(223個)進行KEGG通路富集，最顯著的前20條通路見圖5，包括吞噬體、細胞間受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、氨基糖和核苷酸糖代謝及HIF-1信號通路等。白烏鱧下調(diào)的471個差異表達基因富集最顯著的前20條KEGG通路見圖6，包括細胞黏附分子通路、凝血與補體級聯(lián)反應信號通路、視黃醇代謝通路、細胞色素P450外源物代謝通路和酪氨酸代謝等。

圖5 白烏鱧上調(diào)差異基因KEGG富集結(jié)果Fig.5 The results of KEGG enrichment of differentially up-regulated genes in albino northern snakehead C. argus var.

圖6 白烏鱧下調(diào)差異基因KEGG富集結(jié)果Fig.6 The results of KEGG enrichment of differentially down-regulated genes in albino northern snakehead C. argus var.

此外，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，酪氨酸代謝通路(Ko00350)為顯著的富集通路。此通路上共檢測到37個基因，比較白烏鱧和烏鱧皮膚組織基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，這37個基因里只有tyrp1、CF_GLEAN_10017395、adh5、hgd基因這4個基因為差異表達基因。

2.4 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標記分析

利用Samtools和GATK檢測到純合型單核苷酸多態(tài)性位點最大值為12 152，最小值為5443，雜合型單核苷酸多態(tài)性位點最大值為54 382，最小值為5588；相較于烏鱧，白烏鱧純合型單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)目多，而雜合型單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)少(表3)。此外，純合型插入缺失標記位點最大值為2003，最小值為916，雜合型插入缺失標記位點最大值為1858，最小值為1072；相較于烏鱧，白烏鱧純合型插入缺失標記位點數(shù)目多，雜合型插入缺失標記位點數(shù)少(表4)。

表3 烏鱧及白烏鱧轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)量統(tǒng)計Tab.3 Summary of single nucleotide polymorphism (SNP) identified in the RNA-seq data of norther snakehead C. argus and albino northern snakehead C. argus var.

表4 烏鱧及白烏鱧轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中插入缺失標記數(shù)量統(tǒng)計Tab.4 Summary of INDEL identified in the RNA-seq data of northern snakehead C. argus and albino northern snakehead C. argus var.

基于轉(zhuǎn)錄組單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標記的結(jié)果，在經(jīng)過篩選后的6578個基因里共找到18 767個單核苷酸多態(tài)性位點，其中10.03%屬于非同義編碼位點，33.31%為下游位點，16.89%為上游位點，2.88%的基因間位點，24.41%為同義編碼位點，12.32%為內(nèi)含子位點(圖7a)。在差異表達基因中找到3個基因符合篩選標準，共發(fā)現(xiàn)5個突變位點(表5)，其中hgd、adh5基因?qū)儆诶野彼岽x通路里的差異表達基因，表明這2個單核苷酸多態(tài)性可能會造成黑色素合成受阻，從而導致白烏鱧皮膚白化。另外，在符合篩選標準的804個基因中找到917個插入缺失標記位點，其中0.87%屬于移碼位點，15.38%為內(nèi)含子位點，3.49%為基因間位點，51.69%為下游位點，28.57%為上游位點(圖7b)。將804個基因與色素沉淀及酪氨酸代謝相關(guān)基因比對，未找到符合條件的插入缺失標記位點。

圖7 單核苷酸多態(tài)性(a)和插入缺失標記(b)的分布Fig.7 The distribution of SNPs (a) and INDELs (b)

表5 突變差異基因Tab.5 Mutation of DEGs

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證

qRT-PCR結(jié)果顯示，選取的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中前10個具有差異表達的基因以及在酪氨酸代謝通路中4個差異表達基因，在烏鱧(n=15)與白烏鱧(n=15)皮膚組織中表達水平趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相吻合(圖8)，表明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果是真實可信的。

圖8 轉(zhuǎn)錄組分析獲得的14個差異表達基因的qRT-PCR驗證結(jié)果Fig.8 Results of the qRT-PCR verification from 14 differentially expressed genes obtained by transcriptome analysis1.干擾素誘導的GTP酶5樣基因；2.XLOC_000762；3.NLR家族CARD域基因；4.嘌呤核苷磷酸化酶樣異結(jié)構(gòu)X1基因；5.補體C7基因；6.角鯊烯單氧酶基因；7.XLOC_022395；8.C-C基序趨化因子17樣的基因；9.唾液酸結(jié)合凝集素基因；10.超長鏈?；o酶A合成酶樣的基因；11.酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因；12.CF_GLEAN_10017395；13.乙醇脫氫酶5基因；14.黑尿酸酶基因.1.interferon-inducible GTPase 5-like gene;2.XLOC_000762;3.NACHT gene;4.purine nucleosidephosphorylase-like isoform X1 gene;5.complement component C7 gene;6.squalene monooxygenase gene;7.XLOC_022395;8.C-C motif chemokine 17-like gene;9.sialic acid-binding lectin-like gene;10.very long-chain acyl-CoA synthetase-like gene;11.tyrp1 gene;12.CF_GLEAN_10017395;13.adh5 gene;14.hgd gene.

3 討 論

白烏鱧作為我國名貴的經(jīng)濟魚類，皮膚顏色呈白色或灰白色，這種漂亮的體色常常成為其市場價值的判斷標準。為提供更多遺傳信息推動白烏鱧遺傳育種工作，筆者利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從分子角度探究烏鱧和白烏鱧的皮膚顏色差異。受外界環(huán)境(光照、溫度和攝食)和自身遺傳學(基因)等多種因素的影響，體色變異在魚類發(fā)育過程中較為常見[14]，已有研究證明，遺傳因素是魚類體色變化的主要決定性因素，由許多基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同控制色素細胞的發(fā)育和形成，最終影響魚類體色變化[5]。隨著測序技術(shù)的不斷進步，學者們利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得大量測序數(shù)據(jù)，從而可以更深入地從遺傳學的角度揭示魚類皮膚顏色調(diào)控機制[12]。

3.1 差異表達基因分析

劉肖蓮等[15]對透明草金魚(Carassiusauratus)的研究表明，透明草金魚與不透明草金魚皮膚轉(zhuǎn)錄組共存在181條差異表達基因，主要富集在MAPK通路、嘌呤代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路，推測草金魚皮膚透明機制的調(diào)節(jié)很可能與抑制黑色素形成以及虹彩細胞中鳥嘌呤合成、色素顆粒轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。而史東杰等[16]對三色錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)膚色調(diào)控基因的研究表明，采取墨色、紅色、白色部位皮膚樣品測序并兩兩比較，獲得的差異表達基因主要富集在細胞過程和環(huán)境信息處理通路，說明三色錦鯉的皮膚生長代謝途徑可能與細胞增殖分化相關(guān)[16]。此外，普通鯉(C.carpio)和金邊鯉(C.carpiovar.jinbian)皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，2475個差異基因主要富集在半胱氨酸代謝途徑、cGMP-PKG信號通路和心肌細胞途徑，表明這些代謝途徑可能與金邊鯉皮膚顏色變異有關(guān)[17]。然而，通過對同屬鯉屬的甌江彩鯉(C.carpiovar.color)進行研究，發(fā)現(xiàn)影響其皮膚不同顏色的主要代謝通路為嘌呤代謝通路、糖酵解與糖代謝合成通路和氧化磷酸化通路[18]。由此可見，魚類體色形成的機制十分復雜，關(guān)于魚類體色沉積的調(diào)控機制尚不清楚，相關(guān)研究仍然十分匱乏。白烏鱧是烏鱧的白化變異種[19]，因其體色特殊極具觀賞價值。本研究中，對烏鱧和白烏鱧皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序得到694個差異表達基因，結(jié)合上述研究，可以推測這694個差異表達基因可能參與皮膚顏色的調(diào)控。

3.2 差異表達基因功能分析

將得到的差異表達基因進行功能富集，發(fā)現(xiàn)其主要與能量代謝、細胞聯(lián)接及酪氨酸代謝通路有關(guān)，尤其是酪氨酸代謝通路被顯著富集。在脊椎動物中，酪氨酸代謝通路已被證實與黑色素合成相關(guān)[20]。酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(Tyrp-1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(Tyrp-2)這3種限制酶是催化真黑色素形成的關(guān)鍵酶，三者協(xié)同調(diào)控合成黑色素[21]。在本研究中，酪氨酸代謝通路上的tyrp1基因表達量顯著上調(diào)，tyrp1能抑制黑色素細胞死亡，與魚類體表色素合成緊密相關(guān)。在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)中也發(fā)現(xiàn)了與本研究結(jié)果類似的結(jié)果，正常褐牙鲆皮膚中tyrp1a基因表達量遠高于白化褐牙鲆[22]；tyrp1a、tyrp1b基因為tyrp1基因的同源基因，主要存在于絕大多數(shù)的硬骨魚類中[23]。湖棲鰭蝦虎魚(Gobiopteruslacustris)皮膚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析顯示，酪氨酸代謝通路上的tyr、tyrp1、tyrp2基因表達量均顯著下降，這很可能是造成湖棲鰭蝦虎魚皮膚呈透明狀的原因[24]。Zhou等[9]研究指出，烏鱧幼魚皮膚中的與黑色素合成緊密相關(guān)的tyr基因的表達量均高于白烏鱧幼魚；但在本研究中，成年白烏鱧和成年烏鱧的tyr、tyrp2基因表達量無顯著變化。tyr基因家族作為調(diào)節(jié)黑色素合成的關(guān)鍵基因，其表達量在魚的不同生長階段存在顯著差異，這可能是幼魚的色素模式逐漸向成魚的色素模式過渡所導致的[25]。類似的研究結(jié)果在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和金鱒(黃色突變型虹鱒)中也有報道，虹鱒的tyr基因的表達量在早期發(fā)育階段顯著高于金鱒，然而在12月齡時虹鱒和金鱒tyr基因的表達量無顯著差異[26]。tyr基因是影響魚類皮膚白化的關(guān)鍵基因，但對魚類皮膚白化調(diào)控的分子機制存在種間特異性[27]。

因此，本研究中烏鱧皮膚白化機制中很可能存在其他調(diào)節(jié)色素沉著的因素，而tyr、tyrp2基因可能不是影響其色素沉著的關(guān)鍵基因。已有研究表明，皮膚中的黑色素沉著還與黑色素小體形成、黑色素小體轉(zhuǎn)運等因素密切相關(guān)，大量載有黑色素的黑色素小體被轉(zhuǎn)運至鄰近的皮膚角質(zhì)細胞，使黑色素最終在皮膚角質(zhì)細胞內(nèi)沉積[28]。在對虹鱒皮膚細胞轉(zhuǎn)錄組的研究中發(fā)現(xiàn)，虹鱒皮膚上的黑色斑點區(qū)域差異表達基因主要富集在細胞聯(lián)接進程上，如細胞黏附分子通路[29]。這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果相同，表明在烏鱧中細胞黏附分子通路上的差異表達基因表達量上調(diào)也可能是影響真皮層黑色素細胞沉積的關(guān)鍵因素之一。然而，在本研究中，酪氨酸代謝通路上的adh5和hgd基因表達量同樣也出現(xiàn)顯著上調(diào)。乙醇脫氫酶是參與機體乙醇代謝的重要酶，已在人體上鑒定出5種，adh5基因編碼乙醇脫氫酶5[30]。哺乳動物相關(guān)研究表明，乙醇脫氫酶不僅參與乙醇代謝，還參與腎上腺素、多巴胺、脂肪酸等物質(zhì)的代謝[31]，而其對黑色素合成的影響還未在其他物種中報道。hgd基因編碼尿黑酸酶，尿黑酸酶可以降解苯丙氨酸和酪氨酸分子[32]。

3.3 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標記分析

在對烏鱧和白烏鱧皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)突變位點分析中，共在6578個基因里找到18 767個單核苷酸多態(tài)性位點，針對酪氨酸代謝通路上的差異表達基因，筆者通過與烏鱧全基因組比對，經(jīng)過單核苷酸多態(tài)性位點預測，在hgd和adh5基因上發(fā)現(xiàn)了錯義突變，而與黑色素合成緊密相關(guān)的tyr基因在兩種魚中無顯著差異。有研究報道，魚類的白化可能受一個或多個基因影響，不同物種間存在差異[33]。研究表明：hps4基因上內(nèi)含子2和外顯子3交界處99 bp片段缺失可能導致斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)白化[34]；不僅tyrp1a基因發(fā)生突變可導致斑馬魚(Daniorerio)黑色素細胞死亡[35]，oca2基因突變也可造成斑馬魚白化[36]；對斑馬魚胚胎的研究表明，單獨敲除tyrp1的1個等位基因并不會造成色素缺失，而同時敲除2個等位基因，導致嚴重黑色素缺失[23]；oca2和mclr基因的突變都可能改變麗脂鯉(Astyanax)的體色[37-38]；有學者利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，與體色緊密相關(guān)的差異基因在野生型黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和白化型黃顙魚皮膚中的表達量差異顯著，而單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標記分析未發(fā)現(xiàn)可能導致白化的突變位點[39]。因此結(jié)合本研究結(jié)果和已有報道可以推測，烏鱧白化并不是由某一個基因突變或某一個基因的表達量減少造成的，而主要由兩種機制共同進行調(diào)控：(1)hgd和adh5基因上單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生錯義突變導致黑色素沉著缺乏；(2)酪氨酸代謝通路中的差異基因在白烏鱧皮膚中表達量下降，導致黑色素沉著量降低。

4 結(jié) 論

筆者從分子角度對烏鱧的白化機制進行解釋，通過高通量測序技術(shù)對烏鱧與白烏鱧皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出694個差異表達基因，通過功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要富集在酪氨酸通路上。此外，分析單核苷酸多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，位于酪氨酸通路上的hgd和adh5基因產(chǎn)生錯義突變，這可為烏鱧后續(xù)的多態(tài)性檢測、群體遺傳多樣性分析等奠定基礎(chǔ)，但有關(guān)遺傳機制的細節(jié)還有待進一步的研究。