石中亞 魏紅麗 栗溫新 鄒東方 黃瑩瑩 葉 霞 李志謙 馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界廣泛種植的重要果樹之一，其漿果美味多汁，深受消費者歡迎。我國種植的葡萄以鮮食品種為主，在采后貯藏過程中易發(fā)生果粒穗梗褐變現(xiàn)象，嚴(yán)重影響葡萄的外觀品質(zhì)和經(jīng)濟價值。葡萄是典型的非呼吸躍變型果實，在生長和發(fā)育過程中乙烯釋放量低，但是在采后貯藏過程中其穗梗的乙烯釋放量比果粒高10～100倍，且一些品種在成熟前有乙烯釋放量明顯增加的現(xiàn)象[1-2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，穗梗褐變與穗梗的呼吸速率和乙烯釋放量有密切聯(lián)系[3-4]。已有研究表明，采用乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)處理陽光玫瑰和無核白葡萄采后果穗，可以明顯抑制穗梗褐變，而乙烯利處理無核白可以加速穗梗褐變[2]；果實轉(zhuǎn)色前用乙烯利處理，可以誘導(dǎo)果實轉(zhuǎn)色和提高乙烯釋放量[5]?？芍蚁┦怯绊懫咸压麑嵃l(fā)育和采后貯藏的重要因素[6-8]，了解葡萄穗梗乙烯合成與調(diào)控機制對葡萄貯藏保鮮具有重要意義。

乙烯合成起始于甲硫氨酸，經(jīng)過SAM合成酶(SAM synthetase)、ACC合成酶(ACC synthase，ACS)和ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)催化形成乙烯[9-10]，其中ACS和ACO是催化乙烯合成的兩個限速酶[11]。研究表明，在呼吸躍變型果實中，乙烯信號路徑的乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor，ERF)轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)控ACS[12-13]和ACO[14]基因的表達(dá)從而參與植物的乙烯合成過程。例如，在香蕉(Musaacuminata)中，MaERF11可以抑制MaACS1和MaACO1的啟動子活性，抑制乙烯合成[15]；在蘋果(Malusdomestica)生長發(fā)育過程中，MdERF2可以通過結(jié)合MdACS1和MdACS3a啟動子關(guān)鍵順式元件脫水應(yīng)答順式元件(dehydration-responsive element，DRE)，抑制上述2個基因的轉(zhuǎn)錄，MdERF3則通過與MdACS1啟動子結(jié)合，上調(diào)其表達(dá)[13]。對葡萄中乙烯合成途徑基因進行研究，發(fā)現(xiàn)在Shiraz葡萄中，VvACS1和VvACO1在果實成熟之前表達(dá)量較高[16]；在無核白葡萄中，VvACS1和VvACO1基因在果實成熟后、在穗梗中大量表達(dá)，且與穗梗中乙烯釋放量呈顯著正相關(guān)，其基因表達(dá)量直接影響采前和采后不同時期穗梗的乙烯釋放量，表明VvACS和VvACO1是調(diào)控葡萄穗梗中乙烯合成的關(guān)鍵基因，但其上游調(diào)控因子并不清晰[1]。葡萄中AP2/ERF超家族共有122個成員，VvERF90屬于ERF IX亞家族，在葡萄果皮、果肉、花序、葉片和莖中都有表達(dá)[17]。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新團隊前期對陽光玫瑰葡萄穗梗褐變現(xiàn)象進行了研究，發(fā)現(xiàn)VvERF90在穗梗褐變過程中表達(dá)較高，且與穗梗中的乙烯釋放呈正相關(guān)[4]。但是在非呼吸躍變型果實中，ERFs反饋調(diào)節(jié)乙烯合成的研究尚鮮見報道，尤其是葡萄穗梗中，乙烯釋放量較高的原因，以及ERF是否可以通過調(diào)控VvACSs和VvACOs基因的表達(dá)，進而影響果實和穗梗生長發(fā)育及衰老，仍有待深入研究。

根據(jù)文獻報道，ERF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控乙烯生物合成過程中發(fā)揮重要作用[4,13]，將VvERF90與擬南芥、蘋果和香蕉中的ERF蛋白進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90與蘋果中可以調(diào)控乙烯合成的MdERF3和MdERF2親緣關(guān)系較近，且穗梗中差異表達(dá)的調(diào)控乙烯合成的關(guān)鍵基因VvACO1上有ERF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合的DRE順式元件，由此推測VvERF90可能是調(diào)控葡萄穗梗中乙烯合成的關(guān)鍵基因。因此，本研究克隆在陽光玫瑰葡萄采后貯藏過程中，與穗梗乙烯釋放呈相關(guān)的ERF家族轉(zhuǎn)錄因子VvERF90(GSVIVT00014265001)，并在擬南芥中進行異源表達(dá)，旨在研究VvERF90與VvACO1之間的互作關(guān)系，探索VvERF90的基因功能，在分子水平上為調(diào)控葡萄穗梗乙烯合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗于2018年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室進行，試驗所用葡萄穗梗材料為采自鄭大葡萄農(nóng)莊種植基地的陽光玫瑰。在果實成熟期采摘果穗，分離穗梗，液氮冷凍后在-80℃條件下保存，用于RNA的提取。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和擬南芥(Arabidopsisthaliana，哥倫比亞型擬南芥)均種植在人工氣候室中，培養(yǎng)條件為23℃，光照/黑暗16 h/8h。

1.2 基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

從葡萄基因組網(wǎng)站中下載VvERF90(GSVIVT00014265001)的氨基酸序列，根據(jù)文獻報道下載擬南芥ERF家族[18]、香蕉MaERF9[19]和MaERF11[15]、蘋果MdERF2和MdERF3[13]的氨基酸序列。利用MEGA7軟件，采用鄰接法(neighbor-joining)和最短演化長度算法(minimal evolution)，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap test設(shè)置為1 000。利用http://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站預(yù)測蛋白分子量及理論等電點。

1.3 引物和基因測序

本試驗利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計VvERF90基因全長擴增、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物和VvACO1基因的qRT-PCR引物及啟動子擴增、酵母單雜交、雙熒光素酶試驗等引物序列，引物合成和基因測序均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers list

1.4 基因克隆及T載體構(gòu)建

利用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒(生工，上海)和植物總RNA抽提純化試劑盒(生工，上海)提取陽光玫瑰葡萄穗軸的基因組DNA和RNA，分別用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA和RNA的質(zhì)量。以提取的RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(TaKaRa，大連)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并將其稀釋至200 ng·μL-1，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

基因全長擴增采用KOD OneTM PCR master Mix試劑盒(東洋紡，上海)，qRT-PCR采用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix試劑盒(TaKaRa，大連)進行。擴增體系為50 μL：PrimerSTAR Max 25 μL；正反引物各2 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(D2500-1，索萊寶，北京)進行回收備用。

使用pClone007 Vector Kit試劑盒(TSV-007,擎科生物，北京)，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pClone007載體上，反應(yīng)體系為10 μL：5×Versatile Simple Vector Mix 2 μL；膠回收產(chǎn)物 2 μL；ddH2O 6 μL。室溫(20～25℃)連接5～10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂板后挑取陽性克隆，進行測序檢測。

1.5 酵母單雜交試驗

VvERF90編碼區(qū)序列連接到pB42AD載體上，VvACO1基因啟動子序列連接到pLaczi載體上。將以上兩種重組質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化酵母EGY48感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于缺失氨基酸SD固體培養(yǎng)基上(SD-Trp/Ura)，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d，然后挑取單克隆稀釋點于添加X-gal的SD-Trp/Ura培養(yǎng)基上，觀察菌落生長狀態(tài)。

1.6 雙熒光素酶(Dual-LUC)試驗

VvERF90編碼區(qū)序列構(gòu)建到35 S啟動子驅(qū)動的pCAMBIA307-6 myc載體上，作為Effector載體；VvACO1啟動子片段構(gòu)建到pGREEN-0800-LUC載體上，作為Reporter載體。將上述兩種質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，注射溫室中生長30 d煙草葉片，具體操作方法參考文獻[20]。熒光素酶活性分析利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027，碧云天，上海)，在Spark酶標(biāo)儀(TECAN，上海)分別測定螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，LUC)和海腎熒光素酶(renilla luciferase,REN)活性。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥

將VvERF90構(gòu)建到pCambia1307-6 myc載體上，利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將含有VvERF90::6 myc的農(nóng)桿菌分別接種于5 mL含利福平和卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)10 h，然后將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 h；5 500 r·min-1離心10 min，收集菌體，用10 mL重懸緩沖液(1/2 MS，5% 蔗糖，0.03% Silwet L-77)懸浮菌體，懸浮2次后，用懸浮緩沖液稀釋至OD600值為0.8。然后通過花序浸潤法侵染野生型擬南芥。收獲的種子記為T0代，播種在含有Kan抗生素的MS培養(yǎng)基平板上進行初步篩選，然后提取DNA，通過PCR鑒定陽性植株。

1.8 VvERF90和AtACO3基因的定量表達(dá)分析

提取陽光玫瑰葡萄采后貯藏第0、第3、第7和第14天穗梗的RNA以及擬南芥轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測陽光玫瑰葡萄穗梗中VvERF90基因的表達(dá)量和擬南芥中AtACO3基因的表達(dá)量，內(nèi)參基因為VvActin和AtGAPDH，具體方法參照文獻[21]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每個試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，利用SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄VvERF90在穗梗褐變過程中的表達(dá)

為探明葡萄穗梗中乙烯合成的調(diào)控機制，對葡萄貯藏期間，穗梗中VvERF90的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90在貯藏0 d的穗梗中表達(dá)量較低，3 d時表達(dá)量升高，7和14 d時表達(dá)量逐漸降低(圖1)。

圖1 VvERF90在陽光玫瑰葡萄穗梗褐變過程中的表達(dá)Fig.1 Expression of VvERF90 during rachis browning of Shine Muscat grape

2.2 葡萄VvERF90的基因序列與蛋白特征分析

以陽光玫瑰葡萄穗梗cDNA為模板，VvERF90-F/R(表1)為引物進行擴增，得到VvERF90序列，測序結(jié)果顯示VvERF90基因的編碼序列(coding sequence，CDS)長度為807 bp，編碼268個氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理論等電點5.64。該基因含有ERF基因家族的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

注：黑色劃線部分為AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；*表示翻譯終止。Note: Black line underlined represent AP2/ERF domain. * denote translation stopped.圖2 VvERF90基因序列信息Fig.2 Sequence information of VvERF90

2.3 葡萄VvERF90基因序列生物信息學(xué)分析

擬南芥中ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為12個亞家族，每個亞家族基因具有獨特的特征[16]。本研究選擇了擬南芥12個亞家族中的部分基因和蘋果、香蕉中與乙烯合成相關(guān)的基因進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)葡萄VvERF90和蘋果MdERF2、MdERF3和擬南芥AtERF101/AtERF2、AtERF100/AtERF1聚為同一分支，均聚類在第IX ERF亞家族(圖3)，VvERF90與蘋果MdERF2親緣關(guān)系較近。結(jié)果表明，VvERF90屬于ERFIX亞家族，與蘋果MdERF2之間可能存在功能上的相似性。

2.4 VvERF90對VvACO1啟動子的調(diào)控分析

克隆含有ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的VvACO1啟動子序列，進行酵母單雜交試驗，結(jié)果顯示，在加有X-gal的缺失氨基酸的培養(yǎng)基上，VvERF90和VvACO1啟動子共同轉(zhuǎn)化酵母之后，菌斑可以生長并變藍(lán)，VvERF90與pLacZi、pB42AD與pLacZi及VvACO1啟動子和pB42AD共同轉(zhuǎn)化酵母之后菌斑沒有變藍(lán)(圖4-A)。表明VvERF90可以結(jié)合VvACO1的啟動子。

為進一步驗證VvERF90對VvACO1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用，將VvERF90構(gòu)建至35 S啟動子驅(qū)動的效應(yīng)載體，VvACO1啟動子構(gòu)建至pGreen0800-LUC報告載體載體。將VvERF90和VvACO1啟動子共同轉(zhuǎn)化煙草葉片，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與空載體相比，VvERF90與VvACO1啟動子共同轉(zhuǎn)化煙草后，LUC相對活性明顯升高，說明VvERF90顯著提高了VvACO1啟動子的活性，可以正調(diào)控VvACO1的表達(dá)(圖4-B)。

圖3 葡萄、擬南芥、蘋果和香蕉ERF蛋白進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of grape,Arabidopsis,apple and banana ERF proteins

2.5 VvERF90基因在擬南芥中異位表達(dá)

為了進一步驗證VvERF90在植物生長發(fā)育過程中的功能，本研究將VvERF90構(gòu)建至植物過表達(dá)載體pCambia1307-6 myc，轉(zhuǎn)化擬南芥。提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，以野生型植株為對照，進行PCR檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系檢測出與陽性質(zhì)粒大小一致的條帶，野生型植株中沒有條帶，表明目的基因VvERF90已導(dǎo)入擬南芥植株中(圖5-A)。與野生型擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)基因株系在生長1周時，與野生型無明顯區(qū)別，生長至4周時，均表現(xiàn)出矮化表型(圖5-C)，對株高進行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系高度明顯低于野生型(圖5-D)。

2.6 轉(zhuǎn)基因VvERF90對擬南芥中AtACO3表達(dá)和乙烯釋放速率的影響

為了進一步探究VvERF90在乙烯合成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，本研究測定了轉(zhuǎn)化后擬南芥乙烯釋放量，及VvERF90和乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)量。與野生型相比，VvERF90在轉(zhuǎn)基因株系中的表量達(dá)較高，而對照株系中未檢測到VvERF90的表達(dá)(圖6-A)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，乙烯合成的關(guān)鍵基因AtACO3(葡萄VvACO1的同源基因)基因表達(dá)量均顯著升高(圖6-B)。同時，轉(zhuǎn)基因擬南芥的乙烯釋放量顯著增加，為WT的2倍(圖6-C)。這些結(jié)果進一步說明，VvERF90可以通過調(diào)節(jié)乙烯合成關(guān)鍵基因VvACO1的表達(dá)，進而調(diào)控乙烯的合成。

3 討論

在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯響應(yīng)因子ERF是最下游的一類轉(zhuǎn)錄因子，已有研究結(jié)果顯示，其家族中多個成員，例如蘋果中的MdERF2[12-13]和MdERF3[14]，可以通過結(jié)合乙烯合成路徑關(guān)鍵基因ACS和ACO啟動子上的DRE或GCC-box順式元件調(diào)節(jié)這兩類基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控植物乙烯合成過程。在葡萄基因組中有122個ERF轉(zhuǎn)錄因子[17]，本研究克隆了在陽光玫瑰葡萄采后貯藏過程中，在穗梗中表達(dá)量與乙烯釋放量呈正相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子VvERF90。聚類分析發(fā)現(xiàn)VvERF90與已報道的蘋果MdERF2和MdERF3的親緣關(guān)系較近，且ACO1基因的表達(dá)趨勢與VvERF90相似，其啟動子上含有ERF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合的DRE順式元件，據(jù)此推測VvERF90可能與蘋果MdERF2和MdERF3有相似功能。通過體內(nèi)和體外試驗驗證檢測及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中ACO3的表達(dá)水平和乙烯釋放量的測定分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90可以結(jié)合VvACO1的啟動子正調(diào)控其表達(dá)，從而增加乙烯的釋放量。

注：A:酵母單雜交試驗分析VvERF90對VvACO1啟動子的結(jié)合；B:雙熒光素酶試驗分析VvERF90對VvACO1啟動子調(diào)控的影響。**表示在P<0.01水平差異顯著。下同。Note:A: Binding analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by yeast one hybrid assay. B: Regulation analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by Dual-LUC experiment. ** indicates significant difference at 0.01 level. The same as following.圖4 VvERF90對VvACO1啟動子的調(diào)控分析Fig.4 Regulation analysis of VvERF90 on VvACO1 promoter

注：A：轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定；B：正常條件下生長1周的轉(zhuǎn)基因植株；C：正常條件下生長4周的轉(zhuǎn)基因植株; D：過表達(dá)擬南芥的株高。WT：陰性對照；P：質(zhì)粒對照；#：不同轉(zhuǎn)VvERF90基因擬南芥株系； M：Marker 2 000。*表示在P<0.05水平差異顯著。下同。Note: A: Identification of transgenic plants by PCR. B: Transgenic plants growing 1 week under normal conditions. C: Transgenic plants growing 4 weeks under normal conditions. D: Height of transgenic plants of Arabidopsis. WT: Negative control. P: Plasmid control. #: Different strains of VvERF90 over-expression. M: Marker 2 000. * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 過表達(dá)VvERF90擬南芥陽性株系鑒定及轉(zhuǎn)基因擬南芥表型Fig.5 Identification of VvERF90 overexpression and phenotype of transgenic Arabidopsis plants

圖6 擬南芥中過表達(dá)VvERF90對AtACO3基因表達(dá)和乙烯釋放速率的影響Fig.6 Analysis of expression of AtACO3 and production of eEthylene in over-expressed VvERF90 Arabidopsis plants

植物中ERF轉(zhuǎn)錄因子可以分為12個亞家族[18]，根據(jù)聚類分析的結(jié)果，VvERF90屬于IX亞家族。已有研究結(jié)果顯示，獼猴桃ERF IX亞家族基因AdERF11～AdERF13在果實成熟過程中，隨著果實成熟表達(dá)量降低[22]，擬南芥ERF IX亞家族基因AtERF102和AtERF105參與植株的抗寒過程[23]，同時，AtERF102～AtERF105在植株的免疫過程也起著重要的作用[23-25]。AtERF1和AtORA59可能是茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯途徑的關(guān)鍵節(jié)點基因，能提高擬南芥對腐生型病原菌的抗性[26-27]；玫瑰ERF IX亞家族基因RhERF092調(diào)控植株對乙烯的反應(yīng)[28]；橡膠樹HbERF-IXc5過表達(dá)可以促進植株的生長和提高植株對非生物脅迫的抗性[29]；蘋果ERF IX亞家族基因MdERF2和MdERF3可以通過調(diào)控乙烯的合成調(diào)節(jié)果實的成熟進程[13]。這些研究表明，ERF IX亞家族基因參與植物生長發(fā)育及逆境脅迫的多種生物學(xué)過程。本研究中，酵母單雜交、雙熒光素酶及VvERF90在擬南芥中過表達(dá)的試驗結(jié)果表明，VvERF90具有調(diào)節(jié)乙烯合成的功能，與蘋果[13]和香蕉[14]中的研究結(jié)果一致，可能是葡萄貯藏期間調(diào)控穗梗中乙烯生成的關(guān)鍵基因，而VvERF90是否與擬南芥、橡膠樹及獼猴桃中的ERF IX家族基因的功能類似，參與抗逆反應(yīng)或果實的成熟過程還有待進一步研究。VvERF90在擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致株高降低，與水稻[30]和小麥[31-32]中報道的ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能類似。ERFIX亞家族基因在不同植物中功能研究的結(jié)果表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育過程中在功能上存在保守性。本研究結(jié)果說明VvERF90參與葡萄中乙烯的合成過程，但其在果實和采后貯藏過程中的功能還有待進一步研究證實。

4 結(jié)論

本研究克隆了葡萄ERF IX亞家族VvERF90轉(zhuǎn)錄因子，長度為807 bp，編碼268個氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理論等電點5.64；VvERF90可以結(jié)合乙烯合成關(guān)鍵基因VvACO1的啟動子并正調(diào)控其表達(dá)，VvERF90轉(zhuǎn)基因擬南芥植株矮化，乙烯釋放量升高。綜上，VvERF90可以調(diào)節(jié)乙烯合成途徑基因VvACO1的表達(dá)。