王文杰，吳翠，宋大章，吳浩蔚

（廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司，廣東汕頭 515071）

人血白蛋白在臨床上主要用于失血?jiǎng)?chuàng)傷、燒傷引起的休克以及腦水腫和損傷引起的顱壓升高等的治療。人血白蛋白制品中加入適量的辛酸鈉，可以保證制品的穩(wěn)定性，但是辛酸鈉有很多生物學(xué)作用，如引起低血糖癥，對(duì)各類(lèi)動(dòng)物有麻醉作用，增加氧的消耗，降低肝臟對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸的清除作用，血管舒張作用以及降低肌肉收縮力等作用[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》三部（2020年版）[2]中規(guī)定，人血白蛋白辛酸鈉含量為“每1 g蛋白質(zhì)中應(yīng)為0.140～0.180 mmol”。筆者長(zhǎng)期使用該方法發(fā)現(xiàn)，該方法重復(fù)性不理想，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室偏差。經(jīng)分析，出現(xiàn)偏差的原因可能是4 mL三氯甲烷揮干后，再加100 μL三氯甲烷溶解殘?jiān)煌耆?，進(jìn)樣溶液濃度不能代表供試品溶液濃度，因此筆者擬刪去藥典中辛酸鈉含量測(cè)定方法中的“將三氯甲烷揮發(fā)至干，另加三氯甲烷100μL溶解殘?jiān)?，即不揮發(fā)至干直接進(jìn)樣，開(kāi)展人血白蛋白辛酸鈉含量測(cè)定（氣相色譜法），對(duì)優(yōu)化前、后的方法進(jìn)行對(duì)比研究，進(jìn)一步提升檢驗(yàn)的效率和水平。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GC-2010Plus氣相色譜儀（配FID檢測(cè)器），日本島津公司；BP21色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 um），澳大利亞SGE公司；CPA225D電子微量天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

辛酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)6827100），純度99.5%，美國(guó)CHEM-SERVICE公司；庚酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)6415900），純度99.5%，美國(guó)CHEM-SERVICE公司；高氯酸（批號(hào)20150701），色譜純，天津政成化學(xué)制品有限公司；三氯甲烷（批號(hào)20160106-2），分析純，廣州化學(xué)試劑廠；人血白蛋白供試品（10 g/瓶，批號(hào)20180712、20180813、20180814、20180815、20180916、20181017），廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司；人血白蛋白質(zhì)控品（批號(hào)20170421-3），廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司；每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標(biāo)回收率溶液，廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用酸改性聚乙二醇毛細(xì)管柱（20 m），柱溫160 ℃，火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度230 ℃，氣化室溫度230 ℃，載氣(氮?dú)?流速為35 mL/min。

辛酸峰與庚酸峰的分離度應(yīng)大于1.5，辛酸峰的拖尾因子應(yīng)為0.95～1.20，辛酸對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，所得辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5%。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取庚酸，加三氯甲烷制成每l mL三氯甲烷中含10 mg庚酸的溶液，即得。

1.3.3 測(cè)定方法

取供試品，用水準(zhǔn)確稀釋成蛋白質(zhì)含量為40～50 g/L的溶液，即為供試品溶液。精密量取供試品溶液0.5 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液30 μL與1.5 mol/L高氯酸溶液0.2 mL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，加蓋，于振蕩器上劇烈混合2 min，以3 000 r/min離心20 min，除去上層水相，小心將三氯甲烷層傾入10 mL試管中，取0.1 μL注入氣相色譜儀。

另精密稱取辛酸對(duì)照品0.15 g，置于10 mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，即為辛酸對(duì)照品溶液。精密量取辛酸對(duì)照品溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL 和 50 μL，分別精密加內(nèi)標(biāo)溶液 30 μL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，同法操作。以各辛酸對(duì)照品溶液峰面積與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積比對(duì)各辛酸對(duì)照品溶液辛酸量（μg）作直線回歸，求得直線回歸方程，并計(jì)算出供試品溶液辛酸絕對(duì)量及供試品辛酸鈉含量。

1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取人血白蛋白質(zhì)控品（批號(hào)20170421-3）作為供試品，重復(fù)測(cè)定6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辛酸鈉含量。

1.3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標(biāo)回收率溶液作為供試品，每個(gè)濃度分別制備3份進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辛酸鈉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性圖譜峰面積的變化

由表1可知，不揮干，直接進(jìn)樣法（優(yōu)化后的方法）所得峰面積較小，這是因?yàn)閮?yōu)化后方法的辛酸對(duì)照品溶液不揮發(fā)至干，直接進(jìn)樣使得濃度變低，峰面積變小，但不影響積分。連續(xù)5針辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD值由藥典方法的0.1%變?yōu)?.0%，但仍符合系統(tǒng)適用性要求（不大于5%）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間由2 d縮短為1 d。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)比較

由表2可知，方法優(yōu)化前、后的重復(fù)性試驗(yàn)RSD值分別為4%、2%。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，F(xiàn)=1.108，P=0.317＞0.05，方差具有齊性，即兩組數(shù)據(jù)精密度無(wú)顯著性差異，表明進(jìn)樣濃度降低并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)比較

由表3可知，藥典方法測(cè)得的9次回收率的平均值為97.7%，RSD值為1.70%；不揮干，直接進(jìn)樣法測(cè)得的9次回收率的平均值為99.7%，RSD值為1.55%。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方法分析，F(xiàn)=7.530，P=0.02＜0.05,兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異。方法優(yōu)化后準(zhǔn)確度更接近100%，這是因?yàn)閮?yōu)化后的方法不受揮干速度的影響[3]，進(jìn)樣溶液比藥典方法均勻，損失量相對(duì)較小。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

應(yīng)用優(yōu)化后的人血白蛋白辛酸鈉含量測(cè)定方法，對(duì)廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)的6批人血白蛋白（10 g/瓶）進(jìn)行辛酸鈉含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。各批次人血白蛋白中辛酸鈉含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，辛酸鈉含量的平均值為0.161 mmol/g蛋白，RSD值為2%，與理論投料量0.160 mmol/g蛋白較接近。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化后的方法不需要將三氯甲烷揮干后再加100 μL三氯甲烷溶解殘?jiān)?，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，減少了揮發(fā)的三氯甲烷對(duì)人和環(huán)境的影響[4-5]。結(jié)果證明，優(yōu)化后的方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度較高，適用于人血白蛋白辛酸鈉含量測(cè)定。