張華緯

(長治學院 生命科學系，山西長治 046011)

杜鵑主要用作觀賞、邊坡綠化、切花瓶插等。然而，由于季節(jié)和極端天氣影響，杜鵑種子在自然環(huán)境條件下生根困難，難以實現(xiàn)快繁市場化，需尋找在短時間實現(xiàn)快速繁殖的方法。組織培養(yǎng)可以解決自然條件對杜鵑生長發(fā)育的限制，能夠加快繁殖培育速度，實現(xiàn)短時間內規(guī)模化、商業(yè)化生產[1]。

本試驗首先對杜鵑種子進行無菌組培獲得無菌苗，之后在不同激素種類和濃度梯度條件下采用無菌苗葉片進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，統(tǒng)計誘導率、觀察成活情況；再利用已產生的愈傷組織，進一步進行增殖培養(yǎng)，并統(tǒng)計增殖率、增殖倍數(shù)等參數(shù)，以得出最合理的激素種類和濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為杜鵑中兩個品種，即露珠杜鵑（Rhododendronirroratum）、馬纓杜鵑（Rhododendrondelavayi）種子，于2018年12月采集自云南昆明植物園，千粒重分別為0.072 3 g、0.297 9 g。

1.2 實驗試劑

WPM培養(yǎng)基（不含糖和瓊脂），北京康倍斯科技有限公司；R2A瓊脂，北京奧博星公司；75%乙醇消毒液，太倉新太酒精有限公司；萘乙酸（NAA），澤葉生物科技有限公司；噻苯?。═DZ），阿拉丁試劑（上海）有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-BA），阿拉丁試劑（上海）有限公司；吲哚乙酸（IBA），山東鑫江化工有限公司；玉米素（ZT），山東鑫江化工有限公司。

1.3 儀器與設備

PHS-3C型pH計，上海何亦儀器儀表有限公司；ESJ-4/ESJ-4B系列電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；LS-100HG立式滅菌鍋，北京海富達科技有限公司；DY-Y6超凈工作臺，江蘇東英實驗設備有限公司。

1.4 試驗設計

1.4.1 高山杜鵑種子無菌幼苗培育

配制好WPM培養(yǎng)基后，將露珠杜鵑、馬纓杜鵑種子進行接種，每個品種各接種30個三角瓶；接種后放在干凈的日光燈的培養(yǎng)架上，觀察并記錄其發(fā)芽數(shù)和生長狀況，試驗周期為60 d。

1.4.2 杜鵑愈傷組織誘導

以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度激素對無菌苗葉片愈傷組織進行誘導培養(yǎng)。激素濃度梯度如下。（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L 和1.0 mg/L，編號A1～A8；（2）0.5 mg/L NAA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，編號 B1～ B6；（3）0.5 mg/L IBA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，編號 C1～ C6；（4）5.0 mg/L 6-BA+IBA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L 和0.5 mg/L，編號D1～D6[2]。每種激素組合均勻接種80個嫩葉片（16只三角瓶×5個嫩葉片），40 d后記錄誘導結果。

1.4.3 杜鵑愈傷組織增殖培養(yǎng)

以WPM為基本培養(yǎng)基，選取規(guī)格一致的愈傷組織，對其進行增殖培養(yǎng)。設計激素種類、濃度如下：（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，編號E1～E6；（2）1.0 mg/L NAA+ZT0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，編號F1～F6。

每種激素組合接種60個外植體（15只三角瓶×4塊愈傷組織），40 d后統(tǒng)計結果。

1.5 試驗方法

1.5.1 杜鵑種子無菌幼苗培育

將三角瓶高壓滅菌、清洗、晾曬備用；配制WPM基本培養(yǎng)基（1.5 L蒸餾水+4.17 g WPM固體，攪拌至固體完全溶解后添加45 g蔗糖），調試pH值為5.8，加入11.25 g瓊脂，加熱并攪拌至液體沸騰[3]；將配制好的培養(yǎng)液裝瓶并進行高溫滅菌2.5 h；超凈工作臺上紫外滅菌30 min，通風30 min；種子用酒精消毒30 s后，再用NaClO3消毒10 min；用鑷子將種子均勻散布在三角瓶的培養(yǎng)基上封口培養(yǎng)。

1.5.2 杜鵑葉片愈傷組織誘導

配制好WPM培養(yǎng)基后，按設計使用量用移液槍將激素加入到培養(yǎng)液中（NAA、6-BA、IBA都是耐高溫的激素，可在配制培養(yǎng)基的同時按設計使用量加入，并對其進行高溫高壓滅菌操作；對于不耐高溫的TDZ，需要在培養(yǎng)液、槍、槍頭等進行高溫滅菌后，再將TDZ加入容量瓶中充分振蕩并做好不同濃度TDZ的標記，再分裝到的三角瓶中）；超凈工作臺用紫外殺菌并通風后，取露珠杜鵑種子產生的無菌苗嫩葉作為外植體，用75%乙醇涮洗3 min，再用5%青霉素溶液浸泡10 min，用無菌水沖洗并吸干，在無菌操作臺上將其剪成3 mm×3 mm的正方小塊，將葉面均勻劃傷后接種到培養(yǎng)基上進行嫩葉愈傷組織誘導培養(yǎng)[4-5]。

1.5.3 杜鵑愈傷組織增殖

將葉誘導出的愈傷組織切成3 mm×3 mm的小塊接入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制及激素加入方法同1.5.1和1.5.2。

1.5.4 觀測指標

本試驗中需要研究的指標及其計算公式如下：

（1）種子發(fā)芽率=（發(fā)芽種數(shù)/未污染的總種數(shù)）×100%；

（2）誘導率=（發(fā)生愈傷組織的葉塊數(shù)/接種的總葉塊數(shù)）×100%；

（3）增殖倍數(shù)=愈傷組織增重總質量/接種時愈傷組織的總質量；

（4）增殖率=增殖的愈傷組織塊數(shù)/接種時愈傷組織的總塊數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同品種杜鵑種子產生無菌苗效果差異

不同品種杜鵑種子對組織培養(yǎng)產生無菌苗的適應能力是不同的。組培60 d發(fā)現(xiàn)，馬纓杜鵑的株高平均為1.0 cm，露珠杜鵑為1.3 cm，之后每周株高大約會增長1.0 mm。當馬纓杜鵑株高為2.0 cm，露珠杜鵑為2.5 cm 時，由于三角瓶容量及生長培養(yǎng)液量的限制，兩種杜鵑株高基本不再變化。露珠杜鵑植株高度、葉面積以及發(fā)芽率均大于馬纓杜鵑，且其污染率小于馬纓杜鵑（見表1），由此可見，在本試驗中露珠杜鵑更適合采用組培方法進行快速繁殖。因此后續(xù)試驗將以露珠杜鵑種子為研究對象。

表1 兩種杜鵑種子組織培養(yǎng)后污染率和發(fā)芽率的統(tǒng)計

2.2 杜鵑葉片愈傷組織誘導

2.2.1 NAA+TDZ

由表2可知，WPM+TDZ+NAA在總體上都可誘導露珠杜鵑產生愈傷組織，幾乎不存在污染及褐化問題，這與王濟紅等[6]的研究成果相似。以NAA 0.5 mg/L為基本生長素，在其濃度不變的情況下，愈傷組織誘導率及組織生長狀況與TDZ濃度變化密切相關。隨著TDZ濃度的升高，誘導率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，TDZ濃度為0.20～0.50 mg/L時，誘導率較高、愈傷組織活力強、生長良好，質地松軟適中，顏色呈現(xiàn)黃綠色。篩選出的最佳配方為WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，此配方下誘導率可達78.75%。

表2 NAA+TDZ對愈傷組織誘導的影響

2.2.2 NAA+6-BA

由表3可知，以NAA（0.5 mg/L）為基本生長素，在其濃度不變的情況下，WPM+6-BA+NAA對于杜鵑愈傷組織的誘導效果總體較差，最高誘導率只有27.50%。隨著6-BA濃度的升高，誘導率先緩慢上升隨后快速下降，當6-BA濃度升高至2.5 mg/L、5.0 mg/L，誘導率僅為8.75%、1.25%，甚至低于單獨添加0.5 mg/L NAA的作用效果（13.75%），表明高濃度的6-BA反而會抑制NAA的作用效果；此外，6-BA濃度的升高會導致愈傷組織出現(xiàn)生長狀況差、質地硬、黃黑色、褐化和污染現(xiàn)象較嚴重等問題。該試驗結果表明，NAA+6-BA不適用于杜鵑組織培養(yǎng)，高濃度6-BA反而會抑制誘導，還會導致高污染現(xiàn)象。

表3 NAA+6-BA對愈傷組織誘導的影響

2.2.3 6-BA+IBA

由表4可知，在以0.5 mg/L IBA為基本生長素，且其濃度不變的情況下，WPM+IBA+6-BA對于杜鵑愈傷組織的誘導效果總體較差，大多數(shù)葉片發(fā)生了褐變現(xiàn)象，誘導率極小。0.5 mg/L IBA的單獨作用效果（誘導率10%）優(yōu)于6-BA加入后的效果。

表4 IBA+6-BA對愈傷組織誘導的影響

由表5可知，在以5.0 mg/L 6-BA為基本生長素，且其濃度不變的情況下，WPM+6-BA+IBA對于杜鵑愈傷組織的誘導效果為本次實驗最差，誘導率僅為0.00%～3.75%。說明WPM+6-BA+IBA激素組合不適用于露珠杜鵑葉片愈傷組織的誘導。

表5 6-BA+IBA對愈傷組織誘導的影響

2.3 杜鵑愈傷組織增殖培養(yǎng)

2.3.1 NAA+TDZ

由表6可知，TDZ濃度在0.3～0.5 mg/L時愈傷組織增殖效果較好，增殖率和增殖倍數(shù)相對較高，增殖率達到了41.67%～68.33%，增殖倍數(shù)在0.95～1.98，愈傷組織活力相對較強。繼續(xù)增加TDZ濃度至1.0 mg/L時，愈傷組織增殖速度減慢，增殖倍數(shù)顯著降低。因此選用0.5 mg/L TDZ、配以基本生長素0.5 mg/L NAA對愈傷組織進行增殖培養(yǎng)為宜。

表6 TDZ和NAA對愈傷組織增殖的影響

2.3.2 NAA+ZT

由表7可知，在基本生長素1.0 mg/L NAA基礎上，加入ZT濃度越高，增殖率越低，增殖倍數(shù)逐級下降，越不利于愈傷組織增殖。表明WPM+ZT+NAA組合不利于露珠杜鵑愈傷組織增殖。

表7 ZT和NAA對愈傷組織增殖的影響

3 結論

（1）馬纓杜鵑和露珠杜鵑的種子在組培中可實現(xiàn)較快發(fā)芽。露珠杜鵑種子發(fā)芽率（88.17%）、苗高及葉面積均大于馬纓杜鵑種子發(fā)芽率，且其污染率（6.1%）小于馬纓杜鵑（11.62%）。

（2）露珠杜鵑葉片愈傷組織的誘導試驗結果表明：使用TDZ+NAA組合使愈傷組織的誘導率較6-BA+NAA及6-BA+IBA的誘導率高；高濃度水平的6-BA在總體上不利于愈傷組織的誘導，會出現(xiàn)愈傷組織生長狀況差、褐化現(xiàn)象和污染現(xiàn)象較嚴重等問題；IBA在任何濃度梯度下都不利于愈傷組織的誘導。露珠杜鵑葉片誘導產生愈傷組織的最佳配方為WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈傷組織誘導率可達78.75%。

（3）露珠杜鵑愈傷組織增殖試驗結果表明：WPM+ZT+NAA不同濃度激素配比的增殖效果差別較大，在基本生長素1.0 mg/L NAA基礎上，加入ZT濃度越高，越不利于愈傷組織增殖，總體上增殖效果不如TDZ+NAA。愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基配方為WPM+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈傷組織增殖率可達68.33%。