張華緯

(長治學(xué)院 生命科學(xué)系，山西長治 046011)

杜鵑主要用作觀賞、邊坡綠化、切花瓶插等。然而，由于季節(jié)和極端天氣影響，杜鵑種子在自然環(huán)境條件下生根困難，難以實(shí)現(xiàn)快繁市場化，需尋找在短時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速繁殖的方法。組織培養(yǎng)可以解決自然條件對杜鵑生長發(fā)育的限制，能夠加快繁殖培育速度，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)[1]。

本試驗(yàn)首先對杜鵑種子進(jìn)行無菌組培獲得無菌苗，之后在不同激素種類和濃度梯度條件下采用無菌苗葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、觀察成活情況；再利用已產(chǎn)生的愈傷組織，進(jìn)一步進(jìn)行增殖培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)增殖率、增殖倍數(shù)等參數(shù)，以得出最合理的激素種類和濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為杜鵑中兩個(gè)品種，即露珠杜鵑（Rhododendronirroratum）、馬纓杜鵑（Rhododendrondelavayi）種子，于2018年12月采集自云南昆明植物園，千粒重分別為0.072 3 g、0.297 9 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

WPM培養(yǎng)基（不含糖和瓊脂），北京康倍斯科技有限公司；R2A瓊脂，北京奧博星公司；75%乙醇消毒液，太倉新太酒精有限公司；萘乙酸（NAA），澤葉生物科技有限公司；噻苯?。═DZ），阿拉丁試劑（上海）有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-BA），阿拉丁試劑（上海）有限公司；吲哚乙酸（IBA），山東鑫江化工有限公司；玉米素（ZT），山東鑫江化工有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)，上海何亦儀器儀表有限公司；ESJ-4/ESJ-4B系列電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；LS-100HG立式滅菌鍋，北京海富達(dá)科技有限公司；DY-Y6超凈工作臺，江蘇東英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 高山杜鵑種子無菌幼苗培育

配制好WPM培養(yǎng)基后，將露珠杜鵑、馬纓杜鵑種子進(jìn)行接種，每個(gè)品種各接種30個(gè)三角瓶；接種后放在干凈的日光燈的培養(yǎng)架上，觀察并記錄其發(fā)芽數(shù)和生長狀況，試驗(yàn)周期為60 d。

1.4.2 杜鵑愈傷組織誘導(dǎo)

以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度激素對無菌苗葉片愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。激素濃度梯度如下。（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L 和1.0 mg/L，編號A1～A8；（2）0.5 mg/L NAA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，編號 B1～ B6；（3）0.5 mg/L IBA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，編號 C1～ C6；（4）5.0 mg/L 6-BA+IBA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L 和0.5 mg/L，編號D1～D6[2]。每種激素組合均勻接種80個(gè)嫩葉片（16只三角瓶×5個(gè)嫩葉片），40 d后記錄誘導(dǎo)結(jié)果。

1.4.3 杜鵑愈傷組織增殖培養(yǎng)

以WPM為基本培養(yǎng)基，選取規(guī)格一致的愈傷組織，對其進(jìn)行增殖培養(yǎng)。設(shè)計(jì)激素種類、濃度如下：（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，編號E1～E6；（2）1.0 mg/L NAA+ZT0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，編號F1～F6。

每種激素組合接種60個(gè)外植體（15只三角瓶×4塊愈傷組織），40 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 杜鵑種子無菌幼苗培育

將三角瓶高壓滅菌、清洗、晾曬備用；配制WPM基本培養(yǎng)基（1.5 L蒸餾水+4.17 g WPM固體，攪拌至固體完全溶解后添加45 g蔗糖），調(diào)試pH值為5.8，加入11.25 g瓊脂，加熱并攪拌至液體沸騰[3]；將配制好的培養(yǎng)液裝瓶并進(jìn)行高溫滅菌2.5 h；超凈工作臺上紫外滅菌30 min，通風(fēng)30 min；種子用酒精消毒30 s后，再用NaClO3消毒10 min；用鑷子將種子均勻散布在三角瓶的培養(yǎng)基上封口培養(yǎng)。

1.5.2 杜鵑葉片愈傷組織誘導(dǎo)

配制好WPM培養(yǎng)基后，按設(shè)計(jì)使用量用移液槍將激素加入到培養(yǎng)液中（NAA、6-BA、IBA都是耐高溫的激素，可在配制培養(yǎng)基的同時(shí)按設(shè)計(jì)使用量加入，并對其進(jìn)行高溫高壓滅菌操作；對于不耐高溫的TDZ，需要在培養(yǎng)液、槍、槍頭等進(jìn)行高溫滅菌后，再將TDZ加入容量瓶中充分振蕩并做好不同濃度TDZ的標(biāo)記，再分裝到的三角瓶中）；超凈工作臺用紫外殺菌并通風(fēng)后，取露珠杜鵑種子產(chǎn)生的無菌苗嫩葉作為外植體，用75%乙醇涮洗3 min，再用5%青霉素溶液浸泡10 min，用無菌水沖洗并吸干，在無菌操作臺上將其剪成3 mm×3 mm的正方小塊，將葉面均勻劃傷后接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)[4-5]。

1.5.3 杜鵑愈傷組織增殖

將葉誘導(dǎo)出的愈傷組織切成3 mm×3 mm的小塊接入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制及激素加入方法同1.5.1和1.5.2。

1.5.4 觀測指標(biāo)

本試驗(yàn)中需要研究的指標(biāo)及其計(jì)算公式如下：

（1）種子發(fā)芽率=（發(fā)芽種數(shù)/未污染的總種數(shù)）×100%；

（2）誘導(dǎo)率=（發(fā)生愈傷組織的葉塊數(shù)/接種的總?cè)~塊數(shù)）×100%；

（3）增殖倍數(shù)=愈傷組織增重總質(zhì)量/接種時(shí)愈傷組織的總質(zhì)量；

（4）增殖率=增殖的愈傷組織塊數(shù)/接種時(shí)愈傷組織的總塊數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種杜鵑種子產(chǎn)生無菌苗效果差異

不同品種杜鵑種子對組織培養(yǎng)產(chǎn)生無菌苗的適應(yīng)能力是不同的。組培60 d發(fā)現(xiàn)，馬纓杜鵑的株高平均為1.0 cm，露珠杜鵑為1.3 cm，之后每周株高大約會(huì)增長1.0 mm。當(dāng)馬纓杜鵑株高為2.0 cm，露珠杜鵑為2.5 cm 時(shí)，由于三角瓶容量及生長培養(yǎng)液量的限制，兩種杜鵑株高基本不再變化。露珠杜鵑植株高度、葉面積以及發(fā)芽率均大于馬纓杜鵑，且其污染率小于馬纓杜鵑（見表1），由此可見，在本試驗(yàn)中露珠杜鵑更適合采用組培方法進(jìn)行快速繁殖。因此后續(xù)試驗(yàn)將以露珠杜鵑種子為研究對象。

表1 兩種杜鵑種子組織培養(yǎng)后污染率和發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)

2.2 杜鵑葉片愈傷組織誘導(dǎo)

2.2.1 NAA+TDZ

由表2可知，WPM+TDZ+NAA在總體上都可誘導(dǎo)露珠杜鵑產(chǎn)生愈傷組織，幾乎不存在污染及褐化問題，這與王濟(jì)紅等[6]的研究成果相似。以NAA 0.5 mg/L為基本生長素，在其濃度不變的情況下，愈傷組織誘導(dǎo)率及組織生長狀況與TDZ濃度變化密切相關(guān)。隨著TDZ濃度的升高，誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，TDZ濃度為0.20～0.50 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率較高、愈傷組織活力強(qiáng)、生長良好，質(zhì)地松軟適中，顏色呈現(xiàn)黃綠色。篩選出的最佳配方為WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，此配方下誘導(dǎo)率可達(dá)78.75%。

表2 NAA+TDZ對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2.2 NAA+6-BA

由表3可知，以NAA（0.5 mg/L）為基本生長素，在其濃度不變的情況下，WPM+6-BA+NAA對于杜鵑愈傷組織的誘導(dǎo)效果總體較差，最高誘導(dǎo)率只有27.50%。隨著6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)率先緩慢上升隨后快速下降，當(dāng)6-BA濃度升高至2.5 mg/L、5.0 mg/L，誘導(dǎo)率僅為8.75%、1.25%，甚至低于單獨(dú)添加0.5 mg/L NAA的作用效果（13.75%），表明高濃度的6-BA反而會(huì)抑制NAA的作用效果；此外，6-BA濃度的升高會(huì)導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)生長狀況差、質(zhì)地硬、黃黑色、褐化和污染現(xiàn)象較嚴(yán)重等問題。該試驗(yàn)結(jié)果表明，NAA+6-BA不適用于杜鵑組織培養(yǎng)，高濃度6-BA反而會(huì)抑制誘導(dǎo)，還會(huì)導(dǎo)致高污染現(xiàn)象。

表3 NAA+6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2.3 6-BA+IBA

由表4可知，在以0.5 mg/L IBA為基本生長素，且其濃度不變的情況下，WPM+IBA+6-BA對于杜鵑愈傷組織的誘導(dǎo)效果總體較差，大多數(shù)葉片發(fā)生了褐變現(xiàn)象，誘導(dǎo)率極小。0.5 mg/L IBA的單獨(dú)作用效果（誘導(dǎo)率10%）優(yōu)于6-BA加入后的效果。

表4 IBA+6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，在以5.0 mg/L 6-BA為基本生長素，且其濃度不變的情況下，WPM+6-BA+IBA對于杜鵑愈傷組織的誘導(dǎo)效果為本次實(shí)驗(yàn)最差，誘導(dǎo)率僅為0.00%～3.75%。說明WPM+6-BA+IBA激素組合不適用于露珠杜鵑葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

表5 6-BA+IBA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 杜鵑愈傷組織增殖培養(yǎng)

2.3.1 NAA+TDZ

由表6可知，TDZ濃度在0.3～0.5 mg/L時(shí)愈傷組織增殖效果較好，增殖率和增殖倍數(shù)相對較高，增殖率達(dá)到了41.67%～68.33%，增殖倍數(shù)在0.95～1.98，愈傷組織活力相對較強(qiáng)。繼續(xù)增加TDZ濃度至1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織增殖速度減慢，增殖倍數(shù)顯著降低。因此選用0.5 mg/L TDZ、配以基本生長素0.5 mg/L NAA對愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)為宜。

表6 TDZ和NAA對愈傷組織增殖的影響

2.3.2 NAA+ZT

由表7可知，在基本生長素1.0 mg/L NAA基礎(chǔ)上，加入ZT濃度越高，增殖率越低，增殖倍數(shù)逐級下降，越不利于愈傷組織增殖。表明WPM+ZT+NAA組合不利于露珠杜鵑愈傷組織增殖。

表7 ZT和NAA對愈傷組織增殖的影響

3 結(jié)論

（1）馬纓杜鵑和露珠杜鵑的種子在組培中可實(shí)現(xiàn)較快發(fā)芽。露珠杜鵑種子發(fā)芽率（88.17%）、苗高及葉面積均大于馬纓杜鵑種子發(fā)芽率，且其污染率（6.1%）小于馬纓杜鵑（11.62%）。

（2）露珠杜鵑葉片愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明：使用TDZ+NAA組合使愈傷組織的誘導(dǎo)率較6-BA+NAA及6-BA+IBA的誘導(dǎo)率高；高濃度水平的6-BA在總體上不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，會(huì)出現(xiàn)愈傷組織生長狀況差、褐化現(xiàn)象和污染現(xiàn)象較嚴(yán)重等問題；IBA在任何濃度梯度下都不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。露珠杜鵑葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的最佳配方為WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)78.75%。

（3）露珠杜鵑愈傷組織增殖試驗(yàn)結(jié)果表明：WPM+ZT+NAA不同濃度激素配比的增殖效果差別較大，在基本生長素1.0 mg/L NAA基礎(chǔ)上，加入ZT濃度越高，越不利于愈傷組織增殖，總體上增殖效果不如TDZ+NAA。愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基配方為WPM+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈傷組織增殖率可達(dá)68.33%。