劉思喜，夏 偉，張 浩，王友娟，劉 芳，李勤芳，吳 林

（青島中仁動物藥品有限公司，山東 膠州 266300）

新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒引起的一種高度接觸性禽類烈性傳染病[1]。病毒存在于病禽的所有組織器官、體液、分泌物和排泄中，以腦、脾、肺含毒量最高。雞群發(fā)病后不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和病理變化，無季節(jié)性，無品種差異[2]。雞群發(fā)病初期以呼吸道癥狀為主，后期主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能紊亂、出血等[3]。

新城疫尚無有效治療藥物，只能依靠嚴格消毒、隔離和用疫苗接種預防[4]。近年來，各地各有關(guān)部門按照國家總體部署，堅持預防為主，切實落實免疫、監(jiān)測、撲殺、消毒、無害化處理等各項綜合防治措施，加大防控工作力度，疫情發(fā)生幾率明顯下降，感染率總體維持在較低水平，全國防控工作取得顯著成效。但局部地區(qū)病毒污染比較嚴重，疫情呈持續(xù)性地方流行。

目前市面上常用的用于治療新城疫的藥物主要有中草藥類（板青顆粒類[5]、雙黃連可溶性粉）、中藥多糖類[6]（黃芪多糖、香菇多糖、滸苔多糖）、生物制品類（干擾素[7]、核酸類[8]），公司現(xiàn)有的藥物中主要有 5種，分別為板青顆粒、滸苔多糖、30 % α干擾素 + 30 % β干擾素 +40 % β白細胞介素、免疫核酸、核酸糖肽，對這5種藥物的治療效果進行了試驗效果評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物樣品 1、2、3、4、5號共 5種抗病毒藥物，分別對應(yīng)板青顆粒、滸苔多糖、30 % α干擾素 + 30 % β干擾素 + 40 % β白細胞介素、免疫核酸、核酸糖肽 5種藥物，藥物樣品處理見下表 1。用藥期間每個試驗組的飲水、采食、給藥均是獨立的系統(tǒng)，飲水喂藥期間全天飲水給藥，上午和下午及晚間更換 3次新配置的藥，連用5 d，雞群自由飲水。

表1 藥物樣品 （ml）

1.1.2 血凝與血凝抑制試驗用試劑 1 % 雞紅細胞懸液，新城疫病毒（尿囊液），新城疫陽性血清，待檢雞血清。

1.1.3 試驗動物及病毒 （1）試驗動物。21日齡SPF雞，購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，試驗期間籠養(yǎng)，按飼養(yǎng)規(guī)程進行日常管理，自由采食、飲水。（2）試驗用病毒。新城疫病毒為本實驗室保存，攻毒前經(jīng)SPF胚傳代1次。

1.1.4 儀器設(shè)備 SPF雞飼養(yǎng)隔離器及配套設(shè)施、肉雞飼養(yǎng)設(shè)施（雞籠、料槽、飲水器、清掃設(shè)備等）、小臺稱、超凈工作臺、離心機、高壓鍋、孵化箱、微量移液器、微型振蕩器、96孔V型微量反應(yīng)板等。

1.2 方法

1.2.1 毒株復壯及EID50測定 試驗用NDV毒株經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，每胚0.2 ml，37 ℃培養(yǎng)，48 h后收集尿囊液，用于下一步試驗。

用無菌生理鹽水將收獲的病毒尿囊液做 10倍系列稀釋，每個稀釋度接種5枚9日齡SPF雞胚，每胚接種0.2 ml，置于37 ℃ 下孵化4 d，觀察記錄雞胚死亡情況，棄掉24 h內(nèi)死亡的雞胚。收獲尿囊液后用血凝試驗檢測雞胚的感染情況，按Reed-Muench方法計算EID50值。

1.2.2 攻毒試驗 取 15只 SPF雞，分成 3組，每組5只，分別以105EID50、104EID50、103EID50（標記為 N1組、N2組、N3組）的劑量，通過滴鼻的方式攻毒進行預試驗，每天做好發(fā)病死亡情況的記錄，計算發(fā)病率和死亡率。

1.2.3 試驗動物分組 試驗選取 21日齡 SPF雞56只，隨機分為7組，每組8只雞。根據(jù)攻毒毒株 EID50和預試驗結(jié)果，確定攻毒劑量為104EID50，采用滴鼻的方式進行攻毒。攻毒后，每天做好死亡記錄，計算死亡率和保護率。具體分組和處理方式見表2。

表2 SPF雞試驗分組與處理

1.2.4 測定指標與測定方法 （1）保護率測定。每天詳細記錄各組雞只死亡情況。解剖死亡的雞只，觀察感染后臨床癥狀。測定死亡率和保護率。（2）雞只日增重情況。每天空腹稱重 1次，計算日增重。（3）新城疫抗體檢測。對照組及所有用藥組在攻毒前及攻毒第 5天、第 10天、第 14天，每組隨機抽取 3只雞，每只雞靜脈采血 0.5 ml，注入潔凈離心管內(nèi)，3 000 rpm/min離心 5 min，吸出血清保存于 -20 ℃ 下備用。采用血凝及血凝抑制試驗的方法檢測新城疫抗體，使用抗原為攻毒毒株。（4）統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)采用 Excel進行處理后，采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行比較分析，得出試驗藥品對試驗雞體重、抗體水平、保護率的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 毒株EID50

病毒作 10倍系列梯度稀釋后接種雞胚的感染情況如表 3，經(jīng)過計算可得攻毒毒株的EID50/0.2 ml=10-5.83，即該病毒作 10-5.83稀釋，接種0.2 ml能使半數(shù)雞胚感染。

表3 攻毒毒株EID50的計算

距離比例=（高于 50 % 的死亡分數(shù) -50 %）/（高于 50 % 的死亡百分數(shù)-低于 50 %的死亡百分數(shù)）=（100 %-50 %）/（100 %-40 %）=0.83，EID50的對數(shù)=高于 50 % 病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù) =-5+0.83×（-1）= -5.83，則 EID50=10-5.83，0.2 ml。

2.2 攻毒量確定

結(jié)果顯示，N1組的5只SPF雞在第5天的時候全部死亡，而N3組的5只雞到攻毒后第7天僅出現(xiàn)1只死亡，故確定N2組的104EID50的攻毒劑量作為正式試驗的攻毒量。

圖1 不同攻毒劑量雞只存活情況

2.3 臨床癥狀和保護率

攻毒對照組和用藥組SPF雞在第3天開始出現(xiàn)明顯癥狀，羽毛臟亂堆擠在一起，精神萎靡不振，飼料用量、飲水量減少；臥伏于籠中，不愛走動，后期雙翅麻痹、下垂；排黃綠色及黃白色稀便。攻毒對照組在 5 d時雞只開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，用藥組A-D的雞只也陸續(xù)出現(xiàn)死亡；而用藥組E在5 d雞死亡1只后，隨后就沒有出現(xiàn)雞死亡現(xiàn)象，一直保持穩(wěn)定，精神狀態(tài)也在逐漸好轉(zhuǎn)。試驗期雞只存活情況如表4、圖2。

圖2 試驗期雞只存活情況

表4 各試驗組雞只存活情況及保護率

空白對照組SPF雞未出現(xiàn)任何的臨床癥狀，精神正常，體重逐步增加，食欲和飲欲良好。

剖檢病死雞可見：羽毛臟亂、消瘦，肛門周圍被排泄物污染。剖檢可見鼻腔和氣管內(nèi)有黏液，氣管黏膜水腫出血，肺臟出血；腺胃乳頭出血，十二指腸出血，小腸黏膜出血，胰腺出血；腎臟腫大出血，輸尿管有尿酸鹽沉積。部分剖檢病變?nèi)鐖D3?？瞻讓φ战M的雞解剖無病變。

圖3 攻毒組死亡雞剖檢結(jié)果

2.4 體重變化

攻毒對照組與各用藥組在攻毒后第 2天開始出現(xiàn)體重下降，之后體重不斷下降，各組體重變化趨勢基本一致（除用藥組 E外）。由于各組雞只死亡情況有異，故體重數(shù)據(jù)的采集天數(shù)有所不同，其中用藥組B的體重數(shù)據(jù)采集到第8天，用藥E組采集到第10天，其他各組在第6~8天的時候雞只死亡較多，無法采集有效數(shù)據(jù)。

飼喂5號藥品的用藥組E表現(xiàn)出了良好的治療效果，只死亡了 1只雞，隨后雞的精神狀態(tài)開始恢復，采食量增加，體重回升。

試驗期間，空白對照組的雞只體重保持上升趨勢。

2.5 抗體水平變化

對照組及所有用藥組在攻毒前及攻毒第 5天、第10天、第14天，每組隨機抽取3只雞，采用血凝及血凝抑制試驗的方法檢測新城疫抗體，結(jié)果如表5。

表5 NDV抗體檢測結(jié)果（log2）

結(jié)果顯示，所有SPF雞在攻毒前均無新城疫抗體，攻毒第 5天開始產(chǎn)生抗體，抗體水平很低。隨后攻毒組、用藥組 A-D出現(xiàn)雞只大量死亡，到第 10天已無雞只存活，未能持續(xù)監(jiān)測抗體；而用藥組E雞只存活率很高，抗體水平在第10天、14天檢測中逐漸升高，顯示了很好的保護效果。

空白對照組一直無新城疫抗體。

3 討論

（1）攻毒后，雞只體重都開始呈現(xiàn)下降趨勢，各組雞只死亡有差異，用藥 C組只采集了6 d的數(shù)據(jù)，用藥E組則采集了10 d的數(shù)據(jù)，其他各組在 6~8 d出現(xiàn)死亡較多，無法采集全面數(shù)據(jù)，因此各組的數(shù)據(jù)采集無法保持同步，出現(xiàn)了一定的差異。

（2）10 d后只有藥物組 E有較多雞只存活，其他組雞只已經(jīng)全部死亡，沒有抗體數(shù)據(jù)可以體現(xiàn)。

（3）本試驗中核酸糖肽在新城疫治療方面顯示了良好的治療效果，死亡率低，有效保護率達到了75 %，體重也逐漸恢復到正常標準，抗體水平逐漸升高。而板青顆粒、滸苔多糖、30 % α干擾素 + 30 % β干擾素 + 40 % β白細胞介素、免疫核酸在本次試驗中并未體現(xiàn)出理想的治療效果，可能跟表達的新城疫抗體水平不高有關(guān)系，需要進一步開展研究。