王雪妍， 岳丹丹， 潘夢詩， 張志龍， 張英濤

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

瓜類細菌性果斑病是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）引起的種傳性細菌病害，可侵染葉子也可侵染果實［1-2］. 目前該病害的防治手段主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治手段不利于環(huán)境保護，且殘留的藥物會危害人畜健康，因此生物防治成為解決化學(xué)防治弊端的重要措施. 本試驗從土壤中分離篩選得到一株瓜類細菌性果斑病的生物防治菌株BP-12，并對其進行了鑒定，又從溫度耐受性、pH耐受性以及紫外照射時間耐受性3個方面對該菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性展開研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

土壤樣品取自河南省周口市種植西瓜的土壤. 病原菌來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號ACCC05732.

1.1.2 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.3.

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂18 g/L，pH 7.3.

KB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、K2HPO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、瓊脂18 g/L、甘油10 mL/L，pH 7.2.

1.2 方法

1.2.1 生物防治菌株的篩選

初篩：取10 g 土壤樣品，加入裝有90 mL 無菌水和8～10 個已滅菌的玻璃珠的三角瓶中，180 r/min 振蕩30 min，充分打散土樣，梯度稀釋后取100 μL涂布于NA平板，30 ℃，培養(yǎng)1～2 d；挑取具有明顯差異的菌落，經(jīng)平板劃線純化后，編號并保藏備用.

復(fù)篩：挑取病原菌種于NB培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h；吸取病原菌液2 mL于KB平板上，輕輕晃動平板，將菌液布滿整個平板，放置5～10 min；將平板傾斜吸出多余的菌液，開蓋在無菌環(huán)境中晾干培養(yǎng)基平板表面［3］，將初篩得到的菌株點種到平板上，30 ℃，培養(yǎng)48 h；篩選出具有抑菌圈的菌株，并將其進行多次繼代培養(yǎng)，選擇拮抗作用穩(wěn)定且效果較好的菌株.

1.2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定：將初篩出來的菌株BP-12接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)24 h；肉眼觀察菌株菌落形態(tài)，再在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并參照《常見細菌鑒定手冊》進行生理生化特征試驗［4］.

分子生物學(xué)鑒定：提取菌株的基因組DNA，采用通用引物27F/1492R 進行PCR 擴增，引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR擴增體系為25.0 μL，包括無菌雙蒸水17.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，正向和反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL. PCR 反應(yīng)條件為95 ℃，4 min；95 ℃，1 min；52 ℃，30 s；72 ℃，2 min；30 個循環(huán)；72 ℃10 min. 將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，做相似性分析.

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：測序獲得的16S rRNA部分序列經(jīng)BLAST同源比對后，從GenBank中獲取同源性較高且相鄰的種、屬的序列，同時查找相鄰種、屬中模式種的16S rRNA序列，使用MEGA6軟件進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

熱穩(wěn)定性試驗：將菌株BP-12發(fā)酵液均分5份，分別在40、50、60、70、80 ℃條件下處理30 min. 待發(fā)酵液降至室溫后，取不同溫度處理下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

pH穩(wěn)定性試驗：用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將菌株BP-12發(fā)酵液的pH值分別調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8、9、10，室溫下靜置12 h；再將這些發(fā)酵液的pH值調(diào)回到其初始pH值7.3. 取不同pH值處理條件下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

紫外線穩(wěn)定性試驗：將菌株BP-12發(fā)酵液于紫外燈下靜置照射，波長254 nm，功率36 W，高度25 cm，照射時間分別為1、2、3、4、5、6 h. 取不同紫外照射時間處理下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

從土樣中分離得到的菌株BP-12對病原菌的抑菌圈直徑達20.3 mm，30 ℃條件下，在NA平板上培養(yǎng)48 h，肉眼觀測到菌落呈白色圓形不透明狀，表面無褶皺（圖1）；顯微鏡下觀察呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭染色陽性；生理生化特性見表1. 提取菌株BP-12基因組DNA，采用細菌16S rRNA基因通用引物擴增菌株的16S rRNA基因片段，將測序結(jié)果通過BLAST 軟件進行同源性比較，并選取同源性較高的參考菌株的16S rRNA 序列，通過MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）. 菌株BP-12為芽孢桿菌屬，且與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）親緣關(guān)系較近.

圖1 菌株BP-12菌落形態(tài)結(jié)果Fig.1 The colony morphology of the strain BP-12

表1 菌株BP-12的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain BP-12

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的菌株BP-12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BP-12 based on 16S rRNA sequence

2.2 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

2.2.1 熱穩(wěn)定性

菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)不同溫度處理后的抑菌圈變化如圖3 所示. 由圖可知，菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)40、50、60 ℃處理30 min后，抑菌圈直徑與未處理的發(fā)酵液相比差別不明顯；當溫度升高到70 ℃和80 ℃時，抑菌圈直徑變小. 由此說明，隨著溫度的升高，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌活性逐漸降低.

圖3 溫度對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Influence of temperature on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

2.2.2 pH穩(wěn)定性

菌株BP-12發(fā)酵液經(jīng)不同pH處理后的抑菌圈變化如圖4所示. 當pH＜5和pH=10時，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌圈直徑較小，說明抑菌效果不理想；pH值在5～9的范圍內(nèi)，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌圈直徑與對照相比差別不明顯. 由此說明，菌株BP-12發(fā)酵液在弱酸、中性以及弱堿條件下能保持相對穩(wěn)定的抑菌活性.

圖4 pH對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Influence of pH on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

2.2.3 紫外線穩(wěn)定性

菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)不同時間紫外線照射后的抑菌圈變化如圖5 所示. 隨著紫外線照射時間的增加，菌株BP-12 發(fā)酵液的抑菌圈變化不明顯，當紫外照射時間達到6 h 時，抑菌圈直徑仍能達到19.8 mm.由此說明，菌株BP-12發(fā)酵液對紫外線照射有較好的穩(wěn)定性.

圖5 紫外照射對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Influence of ultraviolet irradiation on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

3 討論與結(jié)論

目前，已報道的瓜類細菌性果斑病的生防菌有酵母菌（Pichia anomala）、熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）工程菌株（染色體整合了2，4-二乙酰基間苯三酚）以及芽孢桿菌等［5-7］. 本試驗通過梯度稀釋和平板對峙試驗相結(jié)合的方法篩選得到一株對瓜類細菌性果斑病有拮抗作用的菌株BP-12，抑菌圈直徑20.3 mm. 利用形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進行分類學(xué)地位的確定，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）. 芽孢桿菌是一類種類多、分布廣的好氧性革蘭陽性菌，是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢種群，在植物病害生物防治研究中占有重要地位［8-9］. 其中解淀粉芽孢桿菌能夠防治多種真菌和細菌病害，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，且營養(yǎng)要求簡單，繁殖速度快，是公認的植物病害的生防細菌［10］. 張鳳杰等研究發(fā)現(xiàn)，生防菌解淀粉芽孢桿菌B15的發(fā)酵液對23種植物病原菌具有抑制作用，且對香菇爛筒病、蘋果腐爛病以及黃瓜枯萎病等5種病原真菌的抑制率在90%以上，具有廣譜抑菌性［11］；賈慧慧等從杏樹根系土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌BJ-6，經(jīng)研究該菌對甜瓜細菌性果斑病病原菌有很好的抑制作用，并對甜瓜苗有很好的促生作用［12］.

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生防菌株的抑菌穩(wěn)定性易受到周圍環(huán)境因素的影響，因此，抑菌的穩(wěn)定性對于實際應(yīng)用中的防治效果具有重要作用［13］. 吳艷清等［14］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌YQ5 發(fā)酵液在溫度高于100 ℃時，抑菌率仍高于50%，另對極端pH 環(huán)境以及紫外線照射均不敏感；張亮等［15］研究表明，多黏類芽孢桿菌LRS-1在30～60 ℃范圍內(nèi)對辣椒疫霉病病原菌的抑菌率達60%以上，且在中堿性中抑菌效果保持穩(wěn)定. 本研究篩選到的解淀粉芽孢桿菌BP-12 對瓜類細菌性果斑病病原菌具有良好的抑制作用，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液經(jīng)40、50、60 ℃處理后活性穩(wěn)定，當溫度升高到70 ℃和80 ℃時，抑菌活性降低；發(fā)酵液pH 值為5～9 時，其抑菌圈直徑仍能達到18.3 mm 以上；經(jīng)紫外照射6 h 后，發(fā)酵液的抑菌圈直徑不受影響，表明菌株BP-12 發(fā)酵液具有較好的抗紫外線能力.

綜上，解淀粉芽孢桿菌BP-12在瓜類細菌性果斑病的防治方面具有良好的應(yīng)用前景.