姜 曉， 王志堯， 王 韜， 馬艷妮， 常 霞， 王卓雅

（1.鄭州云德生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002； 2.河南省納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002）

白桐樹(shù)Claxylon indicum（Reinw.ex BL）Hassk在壯醫(yī)藥書(shū)籍和方劑中的藥名為“美巧懷”，《廣西民族藥簡(jiǎn)編》《壯族民間用藥選編》《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等有書(shū)籍中均記載白桐樹(shù)能“祛風(fēng)毒，除濕毒，散瘀腫，調(diào)龍路，通水道，調(diào)谷道，用于發(fā)旺（痹證）”. 另外，《生草藥性備要》《本草求原》《全國(guó)中草藥匯編》《中藥大辭典》、1977年版《中國(guó)藥典》一部、《中華本草》《中藥制劑匯編》、廣州部隊(duì)編《常用中藥手冊(cè)》等中醫(yī)藥書(shū)籍均記載白桐樹(shù)有“祛風(fēng)除濕、散瘀止痛”之效，可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的防治［1-5］.但目前對(duì)于白桐樹(shù)的研究多數(shù)集中于解熱鎮(zhèn)痛、抑菌作用、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，而有關(guān)白桐樹(shù)在抗RA方面研究鮮見(jiàn)報(bào)道. 作者前期研究發(fā)現(xiàn)白桐樹(shù)酚類成分明顯可改善CIA模型小鼠的各種體征.

白桐樹(shù)屬植物含酚類、生物堿、二萜、三萜、皂苷等化學(xué)成分［7-10］，其中酚類（主要是木脂素、新木脂素、香豆素）是該屬植物主要成分［11］，也是有效成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種活性. 目前，關(guān)于白酮樹(shù)酚類成分的研究較少，并未有明確的方法來(lái)提取白桐樹(shù)的酚類成分，這制約了常用民族藥白桐樹(shù)更廣泛的臨床應(yīng)用.因此，研究開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便快捷的白桐樹(shù)酚類化合物提取分離方法，對(duì)于深入研究白桐樹(shù)酚類成分抗RA作用的物質(zhì)基礎(chǔ)以及充分開(kāi)發(fā)和利用壯藥白桐樹(shù)資源具有重要意義.

沒(méi)食子酸是一種常見(jiàn)多酚類物質(zhì)，以沒(méi)食子酸為代表的多酚類化合物在堿性溶液中可將鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物，該類成分在760 nm 左右處有最大吸收，且吸收值與多酚化合物含量成正比，因此可以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量多酚類成分的總含量［12-15］. 因此，本課題以多酚含量為指標(biāo)，對(duì)照品為沒(méi)食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定白桐樹(shù)中的多酚含量，再通過(guò)提取時(shí)間、提取次數(shù)及溶劑體積進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最后再通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝.

1 材料與方法

1.1 儀器

T9紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；生物安全柜（Thermo Scientific）；進(jìn)口二氧化碳培養(yǎng)箱NBS Galaxy170s（Eppendorf）；離心機(jī)（Cence湘儀TDZ5-WS）；酶標(biāo)儀（Bio-rad，型號(hào)Imark）.

1.2 材料試劑

沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)110831-201605）；福林酚（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)921P037）；無(wú)水碳酸鈉（國(guó)產(chǎn)分析純）；甲醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2021年030113）；乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2020年112040）；白桐樹(shù)藥材購(gòu)自河南禹州四季青藥材行.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密稱量沒(méi)食子酸對(duì)照品10.86 mg，并加入適量蒸餾水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.108 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL容量瓶中，再量取6 mL蒸餾水，搖勻后用移液槍吸取0.5 mL福林酚試劑，搖勻并等待1 min，再用移液槍吸取1.5 mL的碳酸鈉溶液（75 g/L），混勻后用蒸餾水定容至刻度線. 在75 ℃下加熱10 min，待冷卻后在760 nm 下測(cè)定吸光度，得到回歸方程Abs=0.998 7×c+0.026 42（R2=0.998 7）.

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱量樣品0.2 g至錐形瓶中，加入25 mL的蒸餾水超聲30 min，共提取3次，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL以下，用蒸餾水定容至50 mL. 各吸取1～10 mL容量瓶中，再加入6 mL水，0.5 mL福林酚試劑混勻，1 min后加入1.5 mL碳酸鈉試劑（75 g/L）混勻后定容，在75 ℃下加熱10 min冷卻后在760 nm 下測(cè)量0、2、4、6 h后吸光度. RSD=1.56%，所以樣品的穩(wěn)定性較好.

1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照1.4.1步驟制作樣品溶液，重復(fù)測(cè)定六次吸光度，在760 nm下測(cè)定吸光度，RSD=0.02%，表明精密度較優(yōu).

1.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照1.4.1步驟制作六份供試品溶液，在760 nm下測(cè)定吸光度，RSD=4.07%，表明重復(fù)性較好.

1.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

按照1.4.1 步驟制作一份供試品溶液，量取9 份1 mL 的供試品溶液到10 mL 的容量瓶中，加入0.1、0.2、0.3 mL 的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，然后再依次加入6 mL水、0.5 mL福林酚混勻，1 min后吸取1.5 mL 碳酸鈉溶液（75 g/L）到容量瓶中，混勻后在75 ℃下加熱10 min，待冷卻后在760 nm下測(cè)吸光度. 加樣回收率平均值為98.10%，RSD=1.72%.

1.5 單因素影響實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法

分別以溶劑體積、超聲時(shí)間和提取次數(shù)為單因素影響實(shí)驗(yàn)變量，根據(jù)提取多酚含量（質(zhì)量比，單位μg/g），選出最適宜的參數(shù)，根據(jù)得出參數(shù)設(shè)置響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的變量和水平，具體實(shí)驗(yàn)情況見(jiàn)下文.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑體積的篩選

稱取0.2 g藥材，分別加入10、25、50、100、150 mL 的蒸餾水，提取兩次，將提取所得的濾液混合，然后濃縮至50 mL 以下，再用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中. 各吸取1～10 mL 容量瓶中，再量取6 mL 水放入內(nèi)，然后用移液槍吸取0.5 mL的福林酚試劑混勻，1 min 后用移液槍加入1.5 mL 碳酸鈉試劑（75 g/L）混勻后定容，在75 ℃下加熱10 min，冷卻后在760 nm 下測(cè)吸光度. 結(jié)果如圖1，可知溶劑體積在100 mL下多酚含量（723.19 μg/g）最大.

圖1 溶劑體積對(duì)提取物中多酚含量的影響Fig.1 Effect of solvent volume on polyphenol content in extract

2.1.2 提取次數(shù)的篩選

稱取0.2 g藥材，加入25 mL蒸餾水，分別提取1、2、3、4、5次，濾液定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法測(cè)吸光度. 結(jié)果如圖2，提取4次時(shí)多酚含量820.9 μg/g最大.

圖2 提取次數(shù)對(duì)提取物中多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction times on polyphenol content in extract

2.1.3 超聲時(shí)間的篩選

稱取0.2 g 藥材，加入25 mL 蒸餾水，提取2 次，超聲時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h. 濾液混勻后定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法測(cè)吸光度，結(jié)果如圖3，超聲時(shí)間2 h多酚含量（735.29 μg/g）最大.

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取物中多酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polyphenol content in extract

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

從單因素影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)論中得到最優(yōu)的溶劑體積為100 mL左右，超聲時(shí)間為2 h左右，提取次數(shù)為4 次左右，為了進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)將采用響應(yīng)面法.

三個(gè)自變量為：A（溶劑體積）、B（超聲時(shí)間）、C（提取次數(shù)）；響應(yīng)值為多酚含量；設(shè)置三水平因素，如表1所示，然后根據(jù)這三個(gè)變量和三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

表1 白桐樹(shù)多酚提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)水平與因素Tab.1 Experimental levels and factors of polyphenol extraction process optimization of Claxylon indicum

2.2.1 模型方差分析

采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)，白桐樹(shù)多酚提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 白桐樹(shù)多酚提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of optimization of polyphenol extraction process of Claxylon indicum

使用Design expert.7.0軟件可得到三因素的方程模型：

式中：E為多酚含量；A為溶劑體積；B為超聲時(shí)間；C為提取次數(shù).

由下表3方差分析表可知P＜0.000 1，該模型顯著，R2為0.997 5；由F值可知，三個(gè)因素A、B、C對(duì)于多酚含量的影響大小順序?yàn)锽（超聲時(shí)間）＞A（溶劑體積）＞C（提取次數(shù)），A2、B2、C2、AB、AC、BC交互影響極為顯著，因此，提取工藝的參數(shù)對(duì)多酚含量的影響較大.

表3 方差分析表Tab.3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 響應(yīng)面分析

三因素A（溶劑體積）、B（超聲時(shí)間）、C（提取次數(shù)）交互影響如圖4～圖6. 由圖4（a）、圖5（a）、圖6（a）的等高線圖可知當(dāng)A（溶劑體積）、B（超聲時(shí)間）、C（提取次數(shù)）取值較小時(shí)等高線密度較大，而當(dāng)取值較大時(shí)等高線密度小，因此在三因素取值較小時(shí)對(duì)多酚含量的影響較為顯著，而當(dāng)取值較大時(shí)對(duì)多酚含量的影響較??；由圖4（b）、圖5（b）、圖6（b）的響應(yīng)面可知，當(dāng)三因素取值較小時(shí)他們的曲線較陡，而當(dāng)取值較大時(shí)曲線較為平緩，因此證明當(dāng)取值較小時(shí)對(duì)多酚含量的影響較大，而取值較大時(shí)對(duì)多酚含量的影響較小，與等高線圖分析結(jié)果一致.

圖4 E=f（A，B）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of E=f（A，B）

圖5 E=f（A，C）響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of E=f（A，C）

圖6 E=f（B，C）響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of E=f（B，C）

經(jīng)過(guò)該實(shí)驗(yàn)，測(cè)得最優(yōu)的工藝提取參數(shù)為：溶劑體積81.59 mL、超聲時(shí)間2.07 h，提取次數(shù)4.29 次，這樣的參數(shù)下得到的多酚含量最好，而在單因素影響實(shí)驗(yàn)中預(yù)測(cè)參數(shù)：溶劑體積100 mL、超聲時(shí)間2 h、提取次數(shù)4次與最終的理論值恰好符合，證明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值有很好的擬合性，在該提取工藝的參數(shù)下可以獲得較優(yōu)的多酚含量值.

3 結(jié)論

本研究以多酚含量為指標(biāo)，對(duì)照品為沒(méi)食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定白桐樹(shù)中的多酚含量，再通過(guò)提取時(shí)間、提取次數(shù)及溶劑體積進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最后再通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳的提取工藝為：樣品的溶劑為水，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為5次，溶劑體積為150 mL. 優(yōu)化的提取工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，對(duì)于壯藥白桐樹(shù)多酚的有效提取具有一定的參考價(jià)值.