鄭智杰，彭曦冉，焦玉珠，唐海麗，陳欣雨，張曉露，王自力，吳海沖

（1.浙江大學動物醫(yī)學中心，浙江 杭州 310058；2.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058；3.上海弗艾柏生物科技有限公司，上海 200092）

牙周病是影響牙齒及其周圍組織的一系列炎性疾病， 為小動物最常見的疾病之一。 犬貓的年齡、品種、遺傳、飲食、棲息地、牙齒護理頻率和口腔菌群狀況等與牙周病的發(fā)生有關(guān)［1］。 越來越多的研究表明牙周病與系統(tǒng)性疾病之間存在相關(guān)性，如中風、心肌梗死和冠狀動脈粥樣硬化與牙周炎有關(guān)； 心血管病變的嚴重程度與牙周感染和炎癥的程度有關(guān)［2-3］。 隨著寵物犬飼養(yǎng)數(shù)量的增加，2歲后犬的牙周病發(fā)病率可達80%［4］，因此，預防牙周病的發(fā)生對寵物犬的健康至關(guān)重要。

牙菌斑和牙結(jié)石是誘發(fā)牙周病的主要原因。近年來，益生菌被用于治療多種疾病，其在牙周病的治療中也逐漸流行起來［5-6］。 該研究旨在確定某公司生產(chǎn)的益生菌牙膏對犬牙菌斑和牙結(jié)石形成的緩解作用， 從而為寵物在使用該功能性產(chǎn)品的功效情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

選用口腔檢查合格、均無牙周疾病、牙齒咬合正常、身體健康狀況良好的比格犬10 只（雌雄兼有，購自濟南金豐實驗動物有限公司），且在試驗前7 天，動物未使用抗生素或其他消炎藥。在試驗開始前，進行全面的臨床和血液生化檢查，確保犬健康狀況良好， 試驗期間每周由獸醫(yī)檢查犬的健康狀況。

1.1.2 犬糧和益生菌牙膏

犬糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，經(jīng)中國廣州分析測試中心檢測符合《實驗動物 配合飼料衛(wèi)生標準》（GB/T14924.2—2001）與《實驗動物 配合飼料營養(yǎng)成分》（GB/T 14924.3—2010）的要求［7-8］。益生菌牙膏，由上海某生物科技公司提供，規(guī)格：100 g/支，主要含有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），每克含滅活益生菌數(shù)量為5×107CFU。

1.1.3 主要儀器設備

電子天平，型號：BSA2202S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；電子臺秤，型號：IW2-150，賽多利斯工業(yè)稱重設備（北京）有限公司產(chǎn)品；全自動血液體液分析儀，型號：XN-1000，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司產(chǎn)品；全自動生化分析儀，型號：7180，日本日立公司產(chǎn)品；全自動凝血分析儀，型號：C3510，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品；低速冷凍離心機，型號：L535R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品； 電子體溫計，型號：MC-347，歐姆龍健康醫(yī)療（中國）有限公司產(chǎn)品；冷光型孔式手術(shù)無影燈，型號：KS05L，汕頭市福利醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；潔牙拋光一體機，型號：ARTSP1，雙博診斷產(chǎn)品；唐伯森口臭檢測儀，型號：Twin Breason Ⅱ，上海榮峰醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

將10 只比格犬分為陰性對照組和益生菌牙膏組，每組5 只，試驗第0 天對所有犬進行潔牙拋光處理。陰性對照組的犬正常飼喂犬糧；益生菌牙膏組的犬每次餐后約0.5 h 給予約4 g/只益生菌牙膏， 用棉簽均勻涂抹在犬口腔牙齒表面， 等待約30 s，防止犬舔舐，30 s 后可自由飲水。益生菌牙膏每天給予2 次，連續(xù)使用28 d。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 牙菌斑、牙結(jié)石評分

牙菌斑、 牙結(jié)石評分測試牙齒分別為上頜：I3、C、P3、P4、M1，下頜：C、P3、P4、M1。 每次評分操作均在動物鎮(zhèn)靜或麻醉狀態(tài)下進行， 使用鹽酸賽拉嗪注射液進行麻醉或鎮(zhèn)靜， 麻醉劑量為7.5～10.0 mg/（kg·BW）， 具體使用劑量以實際情況為準， 補充麻醉劑量不超過該動物首次麻醉劑量的25%。 每次完成操作后，可經(jīng)肌肉注射途徑給予鹽酸苯噁唑注射液，以加快犬蘇醒。

①牙菌斑評分：連續(xù)使用益生菌牙膏28 d，在試驗第14 天、 試驗第29 天各統(tǒng)計每只犬牙齒的牙菌斑情況1 次， 用菌斑顯示劑對測試的牙齒進行染色并用純水沖洗，參考Turesky 等［9］人改良的Quigley-Hein 法對測試牙齒的牙菌斑判定評分，并拍照記錄。 牙菌斑評分標準如下：

a.覆蓋面積：0 分＝牙面無菌斑；1 分＝牙頸部齦緣處有散在的點狀菌斑；2 分＝牙頸部菌斑寬度不超過1 mm；3 分＝牙頸部菌斑覆蓋寬度超過1 mm，但在牙面1/3 以下；4 分＝菌斑覆蓋面積占牙面1/3～2/3；5 分＝菌斑覆蓋面積占牙面2/3 以上。

b.厚度：0 分＝無顏色；1 分＝輕度，點狀或淺紅色；2 分＝中度，紅色；3 分＝重度，深紅色。

c.牙菌斑評分計算：覆蓋面積×厚度，根據(jù)測試牙齒牙菌斑評分計算算術(shù)平均值。

②牙結(jié)石評分：試驗第29 天統(tǒng)計完每只犬牙齒的牙菌斑情況后， 使用Warrick-Gorrel 法統(tǒng)計測試牙齒的牙結(jié)石評分［10］。 具體操作方法為先用軟毛牙刷將牙菌斑刷除，再用純水沖洗干凈，用注射針管吹空氣使牙齒表面變干燥或使用干燥無菌紗布輕柔蘸取殘留水分后進行牙結(jié)石評分。 牙結(jié)石評分標準如下：

a.覆蓋面積：0 分=牙齒表面無牙結(jié)石；1 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍＜24%；2 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍在25%～49%；3 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍在50%～74%；4 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍＞75%。

b.牙結(jié)石評分計算：根據(jù)測試牙齒牙結(jié)石覆蓋面積計算算術(shù)平均值。

1.2.2.2 口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度檢測

試驗第29 天使用韓國Twin Breason Ⅱ唐伯森口臭檢測儀對動物口腔氣體揮發(fā)性化合物H2S和CH3SH 的濃度進行檢測。 具體操作方法：待犬鎮(zhèn)靜或麻醉后，先將犬的嘴張開3～5 s，然后讓犬嘴唇完全閉合保持約30 s，30 s 后在不完全打開嘴唇的情況下，將注射器由犬齒和前臼齒的縫隙伸入口腔內(nèi)部后盡量閉合嘴唇，隨后緩慢拉動活塞抽取約14 mL 氣體， 停留3～5 s 讓氣體發(fā)生充分交換，完成采樣后，立即拔出注射器并與Twin Breason Ⅱ唐伯森口臭檢測儀連接， 測定抽取的口腔氣體揮發(fā)性化合物H2S 和CH3SH 的濃度。 每只犬重復檢測2～5 次，擇優(yōu)選取2 次檢測數(shù)值進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

統(tǒng)計益生菌牙膏使用不同時間階段的牙菌斑評分、牙結(jié)石評分、口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的檢測結(jié)果，所有數(shù)據(jù)均輸入Excel 軟件進行統(tǒng)計分析，各組計量數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”（Mean±SD）的形式表示。產(chǎn)品減少功效參考美國獸醫(yī)口腔健康委員會 （Veterinary Oral Health Council，VOHC）指南（http：//www.vohc.org/）［11］，定義如下：減少幅度（%）=（陰性對照組評分均值-試驗組評分均值）/陰性對照組評分均值×100%。分析益生菌牙膏對犬牙菌斑、 牙結(jié)石和口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的減少功效，當減少幅度≥15%時，說明該產(chǎn)品具有減輕牙菌斑、牙結(jié)石或口臭的功效。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌牙膏對犬牙菌斑形成的影響

由表1 可知， 試驗前所有犬都進行了潔牙處理，所以第0 天的犬牙菌斑評分均為0；連續(xù)給予益生菌牙膏第14 天，陰性對照組、益生菌牙膏組犬牙菌斑評分分別為5.61±1.95、5.63±2.18 （見表1）；與陰性對照組相比，益生菌牙膏組口腔牙菌斑評分均值減少-0.36%（見表2）。 試驗第29 天，陰性對照組、 益生菌牙膏組動物牙菌斑評分分別為9.78±2.93、7.68±1.23 （見表1）； 與陰性對照組相比， 益生菌牙膏組口腔牙菌斑評分均值減少21.47%（見表2）， 說明此款動物益生菌牙膏具有減少犬牙菌斑產(chǎn)生的功效。 圖1 為益生菌牙膏減輕牙菌斑形成功效評分對比，圖2～圖4 分別為試驗前犬的牙齒拋光效果， 以及試驗第14 天和第29 天各組犬牙菌斑染色效果。

圖1 益生菌牙膏減輕比格犬牙菌斑形成功效對比

圖2 試驗前對犬牙齒進行潔牙拋光效果

圖3 試驗第14 天犬的牙菌斑染色情況

圖4 試驗第29 天犬牙菌斑染色情況

表1 試驗第14 天和第29 天比格犬牙菌斑評分結(jié)果

表2 試驗第14 天和第29 天益生菌牙膏減輕比格犬牙菌斑形成功效結(jié)果

2.2 益生菌牙膏對犬牙結(jié)石形成的影響

由表3 可知，試驗第29 天，陰性對照組、益生菌牙膏組犬牙結(jié)石評分分別為1.09±0.40、1.02±0.44（見表3）；與陰性對照組相比，益生菌牙膏組口腔牙結(jié)石評分均值減少幅度6.54%（見表4），低于15%， 說明該公司生產(chǎn)的此款益生菌牙膏不具有減輕犬牙結(jié)石生成的功效。 圖5 為益生菌牙膏對減輕牙結(jié)石形成功效評分對比。

圖5 益生菌牙膏減少比格犬牙結(jié)石形成功效對比結(jié)果（第29 天）

表3 試驗第29 天比格犬牙結(jié)石評分結(jié)果

表4 試驗第29 天益生菌牙膏減輕比格犬牙結(jié)石功效結(jié)果

2.3 益生菌牙膏對犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的影響

由表5 可知，試驗第29 天，陰性對照組、益生菌牙膏組犬口腔氣體揮發(fā)性化合物的濃度分別為（0.74±0.67）ng/10 mL、（1.07±0.44）ng/10 mL； 益生菌牙膏組犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度均值減少幅度為-44.59%（見表6、圖6），低于15%，說明此款動物益生菌牙膏不具有降低犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的功效。

圖6 益生菌牙膏減輕口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度功效對比結(jié)果（第29 天）

表5 試驗第29 天比格犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度檢測結(jié)果

表6 試驗第29 天益生菌牙膏減輕口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度功效結(jié)果

3 討論

牙周病是犬貓最常見的疾病， 與牙周致病菌密切相關(guān)。 牙周病形成的主要病因是牙齒上的微生物菌斑積聚［1］。 隨著病情的發(fā)展，犬牙周病可能會引發(fā)菌血癥、脊椎炎及心臟內(nèi)膜炎等病癥，危及犬的生命［12-13］。 發(fā)現(xiàn)寵物犬出現(xiàn)進食減少、流涎、口臭等現(xiàn)象時，應考慮是否患上該病，及時就診。

該試驗中， 餐后涂抹益生菌牙膏的犬牙菌斑沉積量明顯低于陰性對照組的犬。 而益生菌牙膏組犬在連續(xù)給予益生菌牙膏28 d 后， 第29 天檢測牙結(jié)石和口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的減少功效分別為6.54%、-44.59%，均低于15%，說明此款動物益生菌牙膏不具有降低口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度和牙結(jié)石的功效， 這可能與受試物的性狀或益生菌成分有關(guān)。 雖然試驗中發(fā)現(xiàn)益生菌牙膏能夠降低牙菌斑的形成，但試驗時間有限，不能證明此款益生菌牙膏能夠完全阻止牙結(jié)石的生成。由于牙結(jié)石的形成是牙齒在萌出之后會被一層薄膜覆蓋， 其主要是由于唾液蛋白選擇性地吸附在牙釉質(zhì)的表面而形成的。 犬長期攝食柔軟的食物或流質(zhì)食品， 食物殘渣和口腔中的細菌容易附著在該薄膜上，進而形成牙菌斑和牙垢。 牙結(jié)石由牙菌斑或牙垢通過與犬唾液中某些成分相互作用從而引起鈣磷沉積形成［14-15］。 該研究結(jié)果表明，在犬的飼喂過程中， 補充益生菌牙膏可以有效減少牙菌斑在牙齒表面的堆積， 但不能降低犬口腔氣體揮發(fā)性化合物的濃度。

4 結(jié)論

連續(xù)給予該款益生菌牙膏28 d，在觀測期內(nèi)，能有效抑制比格犬牙菌斑的形成， 但不具有減少牙結(jié)石形成和降低口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的功效。