李慧萍，陳思旭，張 良，史曉娜，劉淑英

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

綿羊梅迪-維斯納病 （maedi-visna disease，MVD） 的病原為梅迪-維斯納病毒 （maedi-visna virus，MVV）［1］。 感染MVV 的病畜以呼吸系統(tǒng)疾病為主要臨床特征，3 歲以上病畜有明顯表現(xiàn)，少數(shù)病畜沒有臨床癥狀但終身攜帶病毒［2］。 MVD 廣泛流行于各養(yǎng)羊大國，近年來印度、墨西哥也相繼報道有MVD 的流行［3-4］。 1966 年我國新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)于田羊場首次發(fā)現(xiàn)MVD［5］，2019 年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物生理學(xué)實驗室研究人員發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古地區(qū)存在MVD 的流行［6］。 目前，MVD 尚無有效的治療方法， 盡管國內(nèi)外都開展了針對MVV 疫苗的研發(fā)，然而效果較差［7-8］。

MVV 為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒， 含3個逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的主要基因 （gag、pol、env），分別編碼3 個結(jié)構(gòu)蛋白（Gag、Pol、Env）［9］。 有研究表明［10］，gag 基因編碼保護DNA 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，其中， 分子量最大的是衣殼蛋白 （capsid protein，CA），在感染過程中能引起機體強烈的抗體反應(yīng)。此外，Preziuso 等［11］利用MVV CA 單克隆抗體經(jīng)免疫組化法對該病毒在綿羊體內(nèi)的分布進行鑒定，發(fā)現(xiàn)在感染MVV 綿羊的肺臟、肺門淋巴結(jié)、乳房、脾、骨髓均有陽性信號。 由此可見，MVV CA 蛋白及其抗體對MVV 的診斷具有重要價值。 目前，國內(nèi)鮮有關(guān)于MVV CA 蛋白研究報道。 該研究通過原核表達方法獲得重組MVV CA 蛋白并制備兔源多克隆抗體， 旨在為進一步研究MVV CA 蛋白的生物學(xué)功能和研發(fā)MVV 血清學(xué)診斷技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

自然感染MVV 的綿羊病肺組織和健康綿羊肺臟組織由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物生理學(xué)實驗室保存。

1.1.2 實驗動物

清潔級新西蘭大白兔，雄性，2 只，體重4～5 kg，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑

膠回收試劑盒、DNA 提取試劑盒、 質(zhì)粒小提試劑盒，購自金百特公司；IPTG，購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans1-T1 感受態(tài)細胞、pEASY?-Blunt E1 原核表達載體、Protein Marker， 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP 標記山羊抗兔IgG、HRP 標記山羊 抗鼠IgG、 氨 芐西林（ampicillin），購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗His 單克隆抗體，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；BCA 蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑， 購自Sigma 公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

PCR 儀（型號：T100）、核酸電泳儀（型號：Mini-Sub Cell GT Cel）、 蛋白電泳儀 （型號：Mini-PROTEAN Tetra）、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號：Trans-Blot Turbo），美國伯樂公司產(chǎn)品；多功能酶標儀（型號：EXL808），美國Bio-Tek 公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（型號：DHZ-C），蘇州培英實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 擴增目的基因及構(gòu)建重組質(zhì)粒

根據(jù)GenBank 已登錄的MVV 內(nèi)蒙古株（GI：MW248468.1）CA基因序列， 運用Primer 5.0 軟件設(shè)計擴增CA基因引物， 上游引物P25-F-1 序列：5′-ATGCAAGCAGGAGGAAGAAGTTGG-3′，下游引 物P25-R-645 序 列：5′-CTAAAATCCTTCTGAGCCCACATCT-3′， 引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。對內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物生理學(xué)實驗室保存的自然感染MVV 的綿羊病肺組織提取DNA，利用MVV LTR 引物［7］對其進行PCR 擴增并將擴增結(jié)果作為陽性對照，以健康綿羊肺臟組織為陰性對照，利用P25-F-1/P25-R-645 引物擴增MVV CA基因，PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 進行膠回收及純化目的片段。 按照pEASY?-Blunt E1 Expression Kit 說明書， 將目的片段和pEASYBlunt E1 表達載體進行連接， 采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細胞， 篩選陽性克隆菌并測序。

1.2.2 MVV CA 重組蛋白原核表達及純化

將重組質(zhì)粒pEASY-E1-CA 和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細胞， 同時設(shè)置空質(zhì)粒對照組、未誘導(dǎo)表達組及誘導(dǎo)表達組， 在含有氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h， 篩選陽性克隆質(zhì)粒，在含有氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基37 ℃搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至OD600nm值達0.5～0.6，誘導(dǎo)表達組及空質(zhì)粒組加入IPTG 誘導(dǎo)8 h， 超聲破碎后經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定MVV CA 重組蛋白的表達及可溶性。 收集上清液，使用親和層析柱（Ni Sepharose excel 5 mL）進行純化，依次用含10 mmol/L 及20 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫雜質(zhì)蛋白， 用400 mmol/L 的咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白3 次， 對純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE 鑒定。 純化后的MVV CA重組蛋白濃度為0.7 mg/mL。

1.2.3 Western blot 鑒定MVV 重組CA 蛋白的表達

將純化的MVV 重組CA 蛋白進行Western blot 鑒定， 以1∶4 000 稀釋的鼠源His 標簽標記的抗體為一抗，以HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1∶1 000稀釋）為二抗，鑒定MVV CA 重組蛋白的表達。

1.2.4 多克隆抗體的制備

取新西蘭大白兔2 只， 試驗組和陰性對照組各1 只， 將純化的MVV CA 重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，分別背部多點注射，蛋白終濃度為0.7 mg/mL，免疫劑量為1 mL/只；一免后進行加強免疫3 次， 即每2 周使用純化的MVV CA 重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化免疫1次，免疫劑量0.7 mg/只；距最后一次免疫7 d 時，心臟采血，分離血清。

1.2.5 多克隆抗體效價測定

采用間接ELISA 方法測定新西蘭大白兔血清中的抗體效價。將純化的MVV CA 重組蛋白稀釋至1 μg/mL（100 μl/孔）包被于96 孔酶標板中，37 ℃包被1 h，PBST 洗滌3 次； 加入5%的脫脂奶粉封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉1 h，PBST 洗滌3次。將制備的多克隆抗體進行倍比稀釋，以免疫前兔血清為陰性對照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次；HRP 標記的山羊抗兔IgG 1∶7 000 倍稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次；100 μL/孔TMB 顯 色液室溫避光顯色5 min，100 μL/孔終止液，反應(yīng)終止后酶標儀測定OD450nm值，以陽性O(shè)D450nm值/陰性血清OD450nm值（P 值/N 值）大于3 為陽性判定標準。

1.2.6 多克隆抗體的特異性鑒定

參照李艷華等［12］報道的提取腫瘤組織全蛋白的方法，提取綿羊健康肺臟組織和MVV 感染羊陽性肺組織的全蛋白，用于Western blot 鑒定多克隆抗體的特異性。 以制備的MVV 重組CA 陽性兔血清為一抗（1∶2 000 稀釋），以HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀釋）為二抗，鑒定多克隆抗體的特異性。

1.2.7 多克隆抗體的免疫組化檢測

采用免疫組化方法，檢測自然感染MVV 綿羊的病肺組織石蠟切片樣本， 以制備的MVV 重組CA 多克隆抗體為一抗（1∶2 000 稀釋），以鏈霉卵白素標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000 稀釋）為二抗，鑒定制備的多克隆抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 MVV CA 基因的擴增及重組質(zhì)粒鑒定

提取自然感染MVV 綿羊病肺組織DNA，經(jīng)PCR 擴增得到LTR 目的片段約291 bp，符合預(yù)期大小。 經(jīng)P25 引物通過PCR 擴增得到片段約651 bp，符合預(yù)期大小。 以健康綿羊肺臟組織的DNA為模板，以P25 引物通過PCR 擴增沒有出現(xiàn)任何條帶。 結(jié)果表明， 對MVV 病肺組織的DNA 經(jīng)MVV LTR 引物鑒定為陽性，可用于MVV CA基因的PCR 擴增， 且P25 引物可以在感染MVV 的病肺中擴增CA 基因（見圖1）。將膠回收產(chǎn)物連接至pEasy-Blunt E1 原核表達載體， 命名為pEASYE1-CA。 測序結(jié)果表明，pEASY-E1-CA 重組質(zhì)粒與GenBank 中 登 錄 的MVV 內(nèi) 蒙 古 株（GI：MW248468.1）CA 基因相比，有2 個堿基發(fā)生同義突變，但對其氨基酸序列并無影響。

圖1 MVV CA 基因PCR 擴增結(jié)果

2.2 MVV CA 基因的蛋白表達、純化及鑒定

菌體破碎后經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測， 發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶性和包涵體的形式存在，約27 kDa，與預(yù)期大小一致， 空質(zhì)粒組和未誘導(dǎo)組無目的蛋白表達（見圖2）。 純化后重組蛋白未見明顯雜蛋白條帶，蛋白純度滿足制備多克隆抗體的要求（見圖3）。 以pEasy-blunt E1 空載體轉(zhuǎn)化至BL21 陽性菌落為對照，Western blot 檢測結(jié)果顯示， 純化MVV CA 重組蛋白試驗組27 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶而對照組沒有條帶， 表明MVV CA 重組蛋白表達正確（見圖4）。

圖2 MVV CA 重組蛋白SDS-PAGE 檢測結(jié)果

圖3 純化后的MVV CA 重組蛋白SDS-PAGE 檢測結(jié)果

圖4 純化后的MVV CA 重組蛋白Western blot 檢測結(jié)果

2.3 多克隆抗體效價測定

以間接ELISA 方法測定多克隆抗體效價，制備的多克隆抗體稀釋度在1∶8 192 時， 陽性血清OD450nm值和陰性血清OD450nm值差值仍較大，陽性血清OD450nm值大于陰性血清OD450nm值3 倍以上，表明制備的多克隆抗體效價較高（見圖5）。

圖5 MVV CA 多克隆抗體效價測定

2.4 多克隆抗體Western blot 特異性鑒定

將從健康綿羊肺臟組織和自然感染MVV 綿羊病肺組織提取的全蛋白進行Western blot 鑒定，結(jié)果顯示，MVV 病肺組織試驗組在約25 kDa 處（與預(yù)期大小相符）有單一特異性目的條帶，而健康羊肺組織試驗組沒有條帶， 表明制備的多克隆抗體特異性識別MVV CA 蛋白（見圖6）。

圖6 MVV CA 多克隆抗體Western blot 特異性鑒定

2.5 多克隆抗體免疫組化檢測結(jié)果

將自然感染MVV 綿羊病肺組織的石蠟切片進行免疫組化檢測。在顯微鏡下觀察可見，棕色的陽性信號主要定位在巨噬細胞的胞漿內(nèi) （見圖7），結(jié)果表明，制備的MVV CA 多克隆抗體可在生產(chǎn)實踐中用于MVV 的檢測。

圖7 MVV CA 多克隆抗體免疫組化檢測

3 討論

在我國社會經(jīng)濟全面發(fā)展的背景下， 養(yǎng)羊業(yè)也得以快速發(fā)展。 但是，MVD 對于規(guī)?；B(yǎng)殖場特別是規(guī)模化種羊場造成了巨大危害。目前，既沒有針對MVD 的有效預(yù)防措施，也沒有較好的治療方法，對于感染MVV 病畜只能采取隔離和撲殺措施［9］，因此，MVD 診斷技術(shù)的研發(fā)對于MVD 的防控有重要意義。 有研究表明［13］，Gag 蛋白是非糖基化的前體分子，通過中間蛋白進行加工，形成了衣殼蛋白（capsid protein，CA）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，MA）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NC），CA 蛋白在感染過程中能引起機體的強烈抗體反應(yīng)。 2005 年，De Andrés 等［14］整理關(guān)于MVV 血清學(xué)診斷方法發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ELISA 檢測方法均包含CA 蛋白作為檢測抗原。因此該試驗選取了MVV CA蛋白作為目的蛋白，相比于古努爾·吐爾遜等［15］和張彥紅等［16］通過原核表達的方法獲得以包涵體形式表達的重組MVV Gag 蛋白，該試驗通過原核表達的方法獲得了可溶性MVV CA 蛋白，SDSPAGE 和Western blot 結(jié)果顯示純化的重組CA 蛋白具有較高的純度和免疫原性， 為后續(xù)建立血清學(xué)診斷方法奠定了研究基礎(chǔ)。

目前， 國內(nèi)外針對CA 蛋白抗體的研究報道較少，而CA 蛋白抗體對深入研究MVV 病毒感染機制有重要作用， 此外CA 蛋白的抗體還能應(yīng)用于MVD 臨床病例的檢測。 Western blot 結(jié)果表明，該試驗制備的多克隆抗體能特異性識別自然感染MVV 的病肺組織中的CA 蛋白； 免疫組化結(jié)果顯示，可見明顯棕黃色陽性信號，主要定位在肺臟中的巨噬細胞的胞漿內(nèi)。 綿羊感染MVV 后，肺臟中巨噬細 胞是MVV 感 染 的靶細 胞［10］，Luján 等［17］、Gayo 等［18］分別用MVV 單克隆抗體進行免疫組化檢測，結(jié)果顯示在巨噬細胞的胞漿內(nèi)有明顯的陽性信號出現(xiàn)，與該研究中免疫組化檢測結(jié)果一致，表明該試驗制備的多克隆抗體可用于MVV 的檢測。

4 結(jié)論

成功獲得可溶性表達的重組MVV CA 蛋白，同時制備的多克隆抗體可以特異性識別MVD 陽性羊病肺中表達的天然CA 蛋白， 且該抗體可初步用于生產(chǎn)實踐中檢測MVV。