王雅寧 于萌萌 張楠 張巍 古林濤

1 山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)(濟南 250000)；

2 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)耳鼻喉科；

3 山東省濟寧市鄒城市兗礦新里程總醫(yī)院； 4 廣州嘉檢醫(yī)學檢測有限公司

先天性聾是人類最常見的出生缺陷之一，在新生兒中的發(fā)病率可達1‰～3‰[1]。遺傳因素是引起先天性聾的最主要原因，根據(jù)我國聾病分子流行病學調(diào)查顯示，常見的耳聾相關(guān)基因主要有GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA及GJB3[2-4]。常染色體隱性非綜合征型聾(autosomal recessive nonsyndromic hearing loss, ARNSHL)在非綜合征型聾中約占80%，常見基因為：GJB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF及CDH23[5]。

MYO15A基因自1995年發(fā)現(xiàn)至今已有200多個突變位點被報道并已證實與耳聾有關(guān)。本研究通過應用高通量測序(高精度臨床外顯測序)對一個耳聾家系樣本進行測序和分析，發(fā)現(xiàn)該家系的致聾突變?yōu)镸YO15A基因上C.3756+1G>A和C.4519C>T(p.R1507)構(gòu)成的復合雜合突變，其中C.4519C>T(p.R1507)突變?yōu)閲鴥?nèi)首次報道的MYO15A基因新的致病位點，報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 研究對象為山東省千佛山醫(yī)院耳鼻咽喉科確診的1個常染色體隱性遺傳性聾核心小家系，包括1名子代雙側(cè)極重度聾患者(2歲，女)，2名表型正常雙親(母親24歲，父親26歲)。子代患者基本信息和體格檢查信息完整，聽力檢測、前庭功能檢查、智力檢查、顳骨CT及顱腦、內(nèi)聽道MRI及耳蝸水成像等影像學檢查結(jié)果完整，且都已簽署倫理知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1高通量測序(高精度臨床外顯PLUS，由廣州嘉檢醫(yī)學檢測有限公司完成) 抽取該家系3人的外周靜脈血3～5 ml，以鹽析法提取基因組DNA，在Sim-100測定DNA濃度，經(jīng)質(zhì)檢合格后，進行上機測序。使用高精度醫(yī)學外顯檢測試劑盒，結(jié)合Illumuna Nextseq 500(Illumuna，加利福尼亞，美國)的高通量測序技術(shù)，對3份家系DNA樣本進行5 177個OMIM上已知明確的致病基因的編碼區(qū)和已知致病的內(nèi)含子進行捕獲測序，詳細步驟如下：①文庫構(gòu)建：經(jīng)Pre-Capture LM-PCR對純化后文庫進行擴增。等量混合文庫后，加入人類外顯子文庫進行雜交，捕獲外顯子區(qū)域，再通過 PCR擴增富集捕獲后產(chǎn)物。擴增后進行上機測序，測序平臺為Illumuna Nextseq 500，讀長模式為單端測序150 bp，每個樣本的平均測序深度至少為224 x。②測序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software 1.7進行處理。③有效數(shù)據(jù)通過BWA (version 0.7.5, http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml)在線軟件與人類參考基因組(genome GRCh37/hg19)對比得到目標基因組序列，得到BAM格式的最初對比結(jié)果。BAM 文件再利用在線軟件Picard (version 1.96, https://sourceforge.net/projects/picard/files/picard-tools/1.96/)、GATK (version3.1-1, https://wiki.rc.usf.edu/index.php/Genome_Analysis_ToolKit_(GATK))與SAMtoolS (version0.1.18)進行去重復、局部重對比和堿基質(zhì)量校正等處理。④使用GATK Haplotype Caller程序在目標區(qū)域找出位點的基因型。使用GATK Variant Filtration過濾突變。

1.2.2高通量測序結(jié)果分析 測序結(jié)果經(jīng)生物信息學方法進行數(shù)據(jù)分析，對變異數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析，檢索嘉檢內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(http://opengk.com/)、dbSNP(單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫)、ESP6500和ExAC(外顯子組整合數(shù)據(jù)庫)等人群數(shù)據(jù)庫，標注單核苷酸多態(tài)性和低頻良性變異。應用預測軟件對變異的保守性、致病性和危害性進行預測。檢索HGMD(人類基因突變數(shù)據(jù)庫)、PubMed(美國國家生物信息中心開發(fā)的基于WEB的生物醫(yī)學信息檢索系統(tǒng))、ClinVar(NCBI主辦的與疾病相關(guān)的人類基因組變異數(shù)據(jù)庫)等數(shù)據(jù)庫，檢索變異相關(guān)文獻，分析文獻內(nèi)容，參考美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會(ACMG)變異分類指南，對變異進行分類，變異類型包括：錯義、無義、同義、移碼、整碼、剪切等，篩選出最為可能的致病基因和突變進行驗證。

1.2.3Sanger測序驗證 通過UCSC網(wǎng)站查找上述候選陽性基因突變位點上下游序列，使用primer5設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，再通過瓊脂糖凝膠電泳法進行分析，然后將擴增產(chǎn)物進行Sanger測序得到基因片段序列，最后將測序結(jié)果與參考基因組序列進行比對，判斷該位點的具體突變情況。

2 結(jié)果

2.1家系臨床表現(xiàn)和遺傳特征分析 該家系為一個兩代常染色體隱性遺傳性聾的3人核心小家系，即兩名正常聽力的父母及1名2歲患兒?；純撼錾鷷r聽力篩查未通過，6月齡時復篩仍未通過，體格檢查及智力發(fā)育正常。影像學檢查示：顳骨CT、顱腦及內(nèi)聽道MRI及耳蝸水成像無明顯異常，聽力學檢查示：鼓室導抗圖為A型，聽性腦干反應(ABR)、聽覺穩(wěn)態(tài)反應(ASSR)顯示為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾，雙耳畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)各頻率未引出。復習患兒病史及進行體格檢查后排除了環(huán)境因素致聾的原因。

2.2高通量測序結(jié)果分析及突變基因變異位點驗證 對患者樣本進行高精度臨床外顯測序，綜合測序質(zhì)量和生物學信息分析，結(jié)合臨床癥狀發(fā)現(xiàn)MYO15A基因上發(fā)生2個復合雜合突變。為驗證測序結(jié)果，對家系中3個樣本進行Sanger測序驗證(圖1)，發(fā)現(xiàn)患者攜帶MYO15A的復合雜合突變C.3756+1G>A和C.4519C>T (p.R1507*)；C.3756+1G>A這個剪切變異來源于父親，位于mRNA剪接區(qū)域，序列高度保守，并且多種計算輔助算法預測這個變異可能會影響蛋白功能。C.4519C>T(p.R1507*)無義變異來源于母親，該突變位于蛋白質(zhì)高度保守的區(qū)域，可能會導致蛋白質(zhì)合成提前出現(xiàn)氨基酸的終止密碼。母親攜帶雜合無義突變C.4519C>T(p.R1507*)，父親攜帶雜合剪切突變 3756+1G>A，這兩個變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫中頻率較低。結(jié)合送檢者的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國ACMG變異分類指南[6,7]，這兩個變異為1類-致病突變，證據(jù)分別都為1個非常強證據(jù)PVS1(pathogenic very strong )，2個中等證據(jù)PM2(pathogenic moderate )和PM3。結(jié)合患兒極重度聾的臨床表現(xiàn)，推斷MYO15A基因上罕見變異C.3756+1G>A和C.4519C>T (p.R1507*)構(gòu)成的復合雜合突變?yōu)樵摶颊咧旅@原因，故該患兒可確診為常染色體隱性遺傳性聾。

圖1 MYO15A變異位點進行Sanger測序驗證

3 討論

MYO15A基因突變被認為是常染色體隱性非綜合征型聾(ARNSHL)最常見的遺傳原因之一，至今已有700多個基因突變被報道，并已證實有200多個變異與疾病有關(guān)，并且變異涉及多種突變類型，其中包括無義突變、剪接、缺失、插入等(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)。

MYO15A基因包含66個外顯子[8]，該基因?qū)е露@的臨床表現(xiàn)為學語前非進行性重度-極重度全頻聽力損失，無前庭癥狀。MYO15A 基因編碼的肌球蛋白XVa是一個含有3 530個氨基酸的大蛋白，是肌球蛋白(myosin)超家族中的一員。肌球蛋白超家族能夠與細胞骨架機動蛋白絲結(jié)合，通過水解ATP生成能量從而產(chǎn)生運動。肌球蛋白XVa存在于人耳中，位于耳蝸及前庭毛細胞靜纖毛的頂端，負責機械-電信號的轉(zhuǎn)換[9]，能夠維持耳蝸毛細胞內(nèi)肌球蛋白組織結(jié)構(gòu)及毛細胞靜纖毛的伸長，對維持人耳的正常聽覺具有重要意義。

本研究對該家系進行了高精度臨床外顯PLUS的檢測和分析，檢測到MYO15A基因的兩個雜合變異C.3756+1G>A和C.4519C>T(p.R1507*),測序結(jié)果顯示這個兩個變異分別遺傳自患者的父親和母親(均為雜合狀態(tài))，從而證實了該家庭中存在常染色體隱性遺傳性聾基因突變，考慮該家系生育耳聾后代的概率為25%。本研究中發(fā)現(xiàn)的C.4519C>T(p.R1507*)位點是MYO15A基因的新致病位點，目前僅2020年伊朗人群中有一例報道[10]，在我國尚屬首次報道。本結(jié)果豐富了我國遺傳性聾基因突變譜，對遺傳性聾的診斷提供了新靶點。

該患者為雙耳極重度感音性聾，為避免出現(xiàn)因聾致啞的情況，已進行了雙側(cè)人工耳蝸植入術(shù)，術(shù)中監(jiān)測顯示雙耳神經(jīng)反應遙測技術(shù)(NRT)反應良好，術(shù)后開機調(diào)試患兒適應性較好，正常進行聽力及言語康復訓練。目前認為盡早進行人工耳蝸植入是此類耳聾患者最有效的治療方式，尤其是對于小于3歲的學齡前重度及極重度聾兒童，人工耳蝸植入可有效地促進其聽力及言語能力的康復，幫助他們重返主流社會。此外，耳聾基因檢測技術(shù)的發(fā)展及普及，可有效避免耳聾家庭再次生育聽障兒童，對優(yōu)生優(yōu)育工作有著不可替代的指導作用。