李陽艷 劉淼,2 張昊晴 李彩云 侯帥 雷冬竹

1 南華大學附屬郴州醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心(郴州 423000)； 2 郴州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科； 3 郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心

先天性聾是人類最常見的出生缺陷之一，目前我國每年大約有3萬例重度聽力障礙新生兒出生[1]，其中超過60%的先天性聾是由遺傳因素導致[2]。導致遺傳性聾最常見的致聾基因為GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA和GJB3基因，而不同種族及地域的突變熱點存在差異[3-5]。本研究擬通過分析郴州地區(qū)2 509例新生兒聽力與上述4個耳聾基因聯(lián)合篩查結果，了解郴州地區(qū)耳聾基因突變攜帶率及主要突變類型，為本地區(qū)耳聾防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2019年7月至2020年12月在郴州市第一人民醫(yī)院分娩的2 509例新生兒為研究對象，篩查前家屬均被告知聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查的相關知識，理解同意后填寫知情同意書。本研究已通過郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2方法

1.2.1聽力篩查及診斷方法 新生兒出生72小時后采用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)進行聽力初篩，未通過者42 天齡時行DPOAE復篩, 復篩未通過者，轉(zhuǎn)診至郴州市新生兒聽力篩查檢測及診斷中心, 3月齡左右行聽性腦干反應(ABR)檢測進行聽力診斷。 聽力損失程度分級:輕度聽力損失為31～50 dB nHL, 中度聽力損失為51～70 dB nHL, 重度聽力損失為71～90 dB nHL, 極重度聽力損失為≥91 dB nHL。

1.2.2耳聾基因檢測方法 新生兒出生72小時后，由工作人員用濾紙采集卡統(tǒng)一編號，采集新生兒足跟末梢血3滴，每個血斑直徑不小于8 mm，室溫下自然晾干，利用高通量測序技術對4個常見致聾基因的20個位點進行檢測，包括:GJB2(c.35delG、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT),SLC26A4(c.281C>T、c.589G>A、IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、IVS15+5G>A、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2162C>T、c.2168A>G),mtDNA12SrRNA(m.1095T>C、m.1494C>T、m.1555A>G)和GJB3(c.538C>T、c.547G>A)。

檢測流程：對干血斑進行基因組DNA提取，利用多重PCR技術擴增富集人基因組DNA中靶序列并同時引入用于樣本識別的樣本標簽序列。多重PCR技術擴增目的片段進行純化后進行物理打斷，然后在多種DNA聚合酶、連接酶、磷酸酶作用下對PCR產(chǎn)物進行末端補平、3'端加“A”，完成特殊接頭在PCR產(chǎn)物兩端的連接，經(jīng)過磁珠純化完成文庫的制備;進行文庫質(zhì)檢，文庫pooling。高通量測序，嚴格執(zhí)行BGISEQ-2000的操作規(guī)范，獲取序列堿基信息;進行信息分析，測序下機后將數(shù)據(jù)上傳至大型機，信息分析人員根據(jù)樣本信息及其對應的樣本標簽信息、接頭信息等使用4個基因20個位點信息分析流程進行分析。

1.2.3全外顯子測序方法 重新采集耳聾基因篩查陰性且確診聽力損失患兒的外周血，利用全外顯子測序技術檢測。全外顯子測序流程：①首先目標序列捕獲與測序：抽取靜脈血5 ml，提取基因組DNA，經(jīng)過LM-PCR擴增并純化后，完成文庫構建，文庫進行pooling、定量及單鏈環(huán)化。環(huán)化后的文庫經(jīng)過make DNB后利用高通量測序儀MGISEQ-2000進行測序，測序類型為PE100+10，得到原始測序數(shù)據(jù)。②序列分析用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)與HG19/HG20進行序列比對，用GATK軟件進行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查詢，生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結果，隨后進行數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。③最后使用Sanger法進行驗證。

2 結果

2.1新生兒聽力篩查結果 2 509例新生兒中，初篩未通過69例(2.75%，69/2 509)，復篩未通過33例(47.83%，33/69)，其中3例新生兒為GJB2基因雜合突變。確診聽力損失患兒5例，其中雙耳輕度聽力損失2例，雙耳中度聽力損失1例，右耳輕度聽力損失1例(左耳正常)，左耳極重度聽力損失1例(右耳正常)，這5例耳聾基因篩查均為陰性。

2.2耳聾基因篩查結果 2 509例新生兒中共有100例檢出耳聾基因突變,攜帶率為3.99%(100/2 509)。其中GJB2基因雜合突變55例(2.19%,55/2 509),SLC26A4基因雜合突變31例(1.24%,31/2 509),mtDNA12SrRNA基因突變5例(0.20%,5/2 509),GJB3基因雜合突變8例(0.32%,8/2 509),GJB3/SLC26A4雙基因雜合突變1例(0.04%,1/2 509)。在檢測的20個位點中，排在前五位的突變位點依次為c.235delC、IVS7-2A>G、c.299_300delAT、c.1229C>T、c.547G>A(表1)。

表1 100例檢出耳聾基因突變新生兒基因篩查位點陽性例數(shù)分布及聽力篩查結果

2.3全外顯子測序結果 5例耳聾基因篩查陰性且確診為聽力損失的患兒中，全外顯子測序檢出4例GJB2基因c.109G>A純合突變，其中雙耳輕度聽力損失2例，右耳輕度聽力損失(左耳正常)1例，雙耳中度聽力損失1例；1例左耳輕重度聽力損失(右耳正常)患兒未檢出基因突變。

3 討論

GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA以及GJB3基因是我國常見的致聾基因，約占70%[6],本組2 509例新生兒中這4個常見耳聾基因攜帶率為3.99%(100/2 509)，稍低于此前文獻報道的4.01%～7.88%[7],可能與本研究樣本量較少及地域差異性有關。本研究中陽性攜帶率排在前兩位的耳聾基因為GJB2和SLC26A4，與文獻[4,8]報道的一致。

GJB2基因純合突變或復合雜合突變可導致先天性聽力損失，本組對象GJB2基因突變攜帶率最高，為2.13%，突變位點攜帶率由高到低排列依次為c.235delC、c.299_300delAT和c.176_191del16，其中c.235 delC位點攜帶率為1.55%，明顯高于其他位點，與文獻[4,5,8]報道一致。c.35delG是GJB2基因在歐洲、美國和伊朗等地區(qū)最常見的致病變異位點[9]，在本組對象中未檢出；本研究檢出47例GJB2基因雜合突變新生兒，其中3例新生兒未通過聽力篩查，2例為c.235delC雜合突變，1例為c.299_300delAT雜合突變，不排除這3例新生兒可能攜帶GJB2基因其他位點突變，構成復合雜合突變而導致聽力篩查未通過，曾建議完善耳聾基因檢測及聽力學診斷，但均已失訪。

SLC26A4 基因又名PDS基因，純合突變或復合雜合突變可導致大前庭水管綜合征、Pendred 綜合征等[10,11]，是僅次于GJB2突變而引起感音神經(jīng)性聾的遺傳學病因。本組對象檢出SLC26A4基因突變21例，攜帶率為1.24%，低于其他研究報道的1.29%～3.68%[7]，其中IVS7-2A>G位點突變攜帶率為0.76%，為本組對象的第二大熱點突變位點。SLC26A4 基因又稱“一巴掌致聾基因”，攜帶該基因突變的患兒在成長過程中，頭部受到外力撞擊或使顱內(nèi)壓增高等誘發(fā)因素都可能導致聽力損失的發(fā)生，通過及早預警和生活指導可預防或延緩聽力損失的發(fā)生。本研究中21例SLC26A4基因突變新生兒均為雜合突變，且聽力篩查通過，故建議聽力隨訪。

本組對象中mtDNA12SrRNA和GJB3基因突變攜帶率分別為0.20%和0.32%，與文獻[4,7]報道一致。mtDNA12SrRNA基因突變可引起藥物性聾，為母系遺傳;本研究中5例mtDNA12SrRNA基因m.1555A>G突變新生兒均通過了聽力篩查，對其及母系家族成員進行用藥指導,終生禁用氨基糖苷類藥物, 可有效避免藥物性聾的發(fā)生。GJB3 基因突變可導致常染色體顯性或隱性遺傳性聾，主要表現(xiàn)為遲發(fā)性高頻聽力下降[12]。本研究檢出6例GJB3基因雜合突變和1例GJB3/SLC26A4雙基因雜合突變新生兒，聽力篩查均通過，應定期復查聽力，及時診治。

本研究對5例耳聾基因篩查陰性但確診聽力損失的患兒進行全外顯子測序，檢測出4例GJB2基因c.109G>A位點純合突變者。GJB2基因c.109G>A位點突變在亞洲地區(qū)攜帶率較高，中國漢族人群攜帶率為6.2%[13]；研究發(fā)現(xiàn)c.109G>A位點純合突變或復合雜合突變可表現(xiàn)出極重度聽力損失至聽力正常等多種表型，以輕度至中度聽力損失為主[14～16]。本研究4例c.109G>A純合突變新生兒于3月齡時確診聽力損失，其中2例為雙耳輕度聽力損失，1例為右耳輕度聽力損失，左耳正常，1例為雙耳中度聽力損失，可見以輕度聽力損失為主。GJB2基因c.109G>A位點突變與遲發(fā)性聽力損失密切相關，隨著年齡的增長，聽力損失逐漸出現(xiàn)[14～17]；本研究中4例c.109G>A純合突變患兒隨著年齡增長，聽力損失是否會逐漸加重，需要繼續(xù)聽力隨訪。

耳聾基因篩查能及時發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性、漸進性及藥物性聾高?；純海瑥浹a單一聽力篩查的不足[18]，在張嬌等[19]新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的系統(tǒng)評價和Meta分析研究中，新生兒聽力篩查通過而基因篩查未通過率為0.22%，其中線粒體基因篩查未通過率占0.20%。文中結果顯示，耳聾基因篩查出耳聾基因突變新生兒100例，其中97例新生兒均通過聽力篩查，可見單一的聽力篩查將會漏篩大部分耳聾高危新生兒，而聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查可擴大隨訪人群，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早干預，有助于預防或延緩聽力損失的發(fā)生。

本研究結果顯示GJB2和SLC26A4基因是郴州地區(qū)新生兒耳聾基因突變的主要類型，雖然對4個耳聾易感基因的20個位點篩查未包括c.109G>A位點，但對5例確診為聽力損失患兒的全外顯子測序檢出GJB2基因c.109G7A位點純合突變者4例；在此前郴州市育齡女性的耳聾基因突變研究中，120例配偶耳聾基因檢測結果顯示，c.109G>A檢出率居首位，達11.67%[20]，提示本地區(qū)c.109G>A攜帶率較高。GJB2基因c.109G>A位點突變聽力表型具有多樣性，人群攜帶率高，重視GJB2基因c.109G>A位點突變的致病性，可將其納入本地區(qū)新生兒耳聾基因篩查范圍內(nèi)。