楊曉蓉 楊啟梅 韓想利 張文

1 陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(西安 710068)

梅尼埃病是臨床常見的耳科疾病，臨床多表現(xiàn)為發(fā)作性眩暈、耳鳴、耳脹滿感及感音神經(jīng)性聽力下降等，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為與內(nèi)淋巴管機(jī)械性阻塞、內(nèi)淋巴吸收障礙、內(nèi)耳缺血、免疫反應(yīng)、遺傳因素及感染等有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)學(xué)說與梅尼埃病發(fā)病關(guān)系密切，內(nèi)淋巴囊中免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞參與內(nèi)淋巴液的吸收，是內(nèi)耳免疫反應(yīng)的部位[2]。有研究報(bào)道，內(nèi)耳可以介導(dǎo)局部免疫炎性反應(yīng)，梅尼埃病患者自身存在免疫紊亂，免疫因素與梅尼埃病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3，4]。梅尼埃病患者存在局部及全身免疫反應(yīng)，對(duì)糖皮質(zhì)激素免疫抑制治療有效，提示其發(fā)病機(jī)制與免疫因素有關(guān)[5]。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)具有免疫抑制功能，在維持細(xì)胞免疫耐受方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞能夠抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用；Treg細(xì)胞功能障礙或數(shù)量減少時(shí)，機(jī)體免疫耐受抑制，免疫功能紊亂，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，進(jìn)而損害自身組織、器官及細(xì)胞，引發(fā)自身免疫性疾病[6]。張菊紅等[7]研究表明，CD4+CD25+Treg細(xì)胞抑制功能下降與自身免疫性感音神經(jīng)性聾發(fā)病關(guān)系密切，其功能或數(shù)量變化與自身免疫性內(nèi)耳疾病小鼠病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Treg作為免疫學(xué)研究的重點(diǎn)近年在慢性炎癥及自身免疫疾病的治療中提供了重要指導(dǎo)?；诿纺岚２〉拿庖邔W(xué)病機(jī)及Treg細(xì)胞可介導(dǎo)免疫耐受，推測(cè)Treg在梅尼埃病的發(fā)病中有重要作用，故本研究通過觀察CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子在梅尼埃病患者外周血中的表達(dá)，探討其在梅尼埃病發(fā)生中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組 納入2019年8月至2021年5月收治的45例梅尼埃病患者作為研究組，以同期健康人群30例作為對(duì)照組。研究組中男7例，女28例，年齡32～68歲，平均44.7±6.9歲；其中緩解期13例，發(fā)作期32例；單側(cè)36例，雙側(cè)9例；聽力分期1期3例，2期20例，3期16例，4期6例。健康對(duì)照組中男12例，女18例，年齡34～69歲，平均45.2±5.8歲。兩組性別、年齡等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

梅尼埃病組納入標(biāo)準(zhǔn)：梅尼埃病診斷參考《梅尼埃病診斷和治療指南(2017)》[8]；無(wú)耳蝸和前庭相關(guān)其他疾??；排除其他原因引起的眩暈；近期未使用免疫制劑、糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物等；無(wú)其他重大疾病等；以患者最近6月內(nèi)間歇期聽力最差時(shí)0.5、1.0、2.0 kHz純音平均聽閾進(jìn)行分期，一期:平均聽閾≤25 dB HL，二期:平均聽閾為26～40 dB HL，三期:平均聽閾為41～70 dB HL，四期:平均聽閾>70 dB HL。健康對(duì)照組患者無(wú)耳鼻疾病，常規(guī)體檢及?？撇轶w均正常。

1.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞檢測(cè) 采集兩組對(duì)象晨起空腹外周靜脈血約5 ml，抗凝管中低溫保存；取新鮮抗凝全血100 μL，梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，加入FITC-CD4抗體、PE-CD25抗體各20 μL，混勻避光反應(yīng)10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清，固定穿孔，加入APC-FOXp3抗體標(biāo)記，多聚甲醛固定，利用流式細(xì)胞儀以CD4設(shè)門，用CD4+CD25+和Foxp3+標(biāo)記Treg細(xì)胞亞群，檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。

1.3外周血PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞相關(guān)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3(Foxp3)mRNA相對(duì)表達(dá)檢測(cè) 采用Trizol法提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，檢測(cè)樣品濃度，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板配置PCR反應(yīng)體系行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，：61 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次，采用2-△△CT法分析TGF-β、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)。引物序列如下：TGF-β上游：5′-TGAAGCACGGAC-AGCCAGACG-3′，下游：5′-CTGCTAGCCAGTCA-GCCGAAT-3′；Foxp3上游：5′-AAGACAGGCCA-TCGGCCAGAAC-3′，下游：5′-TCCACGTGATCG-AGCGGTCGAC-3′；GAPDH上游：5′-GCACGGTGAACGCTCAGAAC-3′，下游：5′-TGCTGAACA-GCCGAGTCGA-3′。

1.4血清IL-10水平檢測(cè) 采用促凝真空采血管采集兩組晨起空腹外周靜脈血約3 ml，待其自然凝固后3 600 r/min離心15 min，收集血清低溫保存；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平，檢測(cè)按操作說明書嚴(yán)格進(jìn)行，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子水平比較 由表1可見，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比、外周血Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)及血清IL-10水平明顯低于健康對(duì)照組，外周血TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量則明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及Foxp3 mRNA、血清IL-10水平高于梅尼埃病緩解期組，緩解期組高于發(fā)作期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)；健康對(duì)照組TGF-β mRNA水平低于梅尼埃病緩解期組，緩解期組低于發(fā)作期組(P<0.05)。

表1 兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子水平比較

2.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子水平與梅尼埃病患者不同聽力分期和單雙側(cè)患耳的關(guān)系 梅尼埃病單、雙側(cè)患者及不同聽力分期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比、血清IL-10及外周血TGF-β、Foxp3 mRNA水平組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2、3)。

表2 單、雙側(cè)梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子水平比較

2.3梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比與TGF-β、Foxp3、IL-10表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比與外周血TGF-βmRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.704，P<0.05)，與血清IL-10水平(r=0.679，P<0.05)和外周血Foxp3 mRNA水平(r=0.725，P<0.05)呈正相關(guān)。

表3 不同聽力分期梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子水平比較

3 討論

T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫和漿細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫是免疫反應(yīng)的兩種，正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠協(xié)調(diào)阻止免疫細(xì)胞對(duì)自身分子及組織、細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)；當(dāng)Treg細(xì)胞功能障礙時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，機(jī)體自動(dòng)識(shí)別抗原，引起一系列免疫反應(yīng)，促進(jìn)慢性炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生[6,9]。Treg細(xì)胞在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，是免疫耐受的關(guān)鍵，相比于正常人群，自身免疫性疾病患者發(fā)病期Treg細(xì)胞水平降低，免疫抑制減輕，機(jī)體呈現(xiàn)高免疫反應(yīng)狀態(tài)；隨著疾病緩解，Treg細(xì)胞水平升高，機(jī)體免疫抑制功能增強(qiáng)，免疫反應(yīng)減弱[10]。而在自身免疫性內(nèi)耳疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞參與該病的病機(jī)為激活的T細(xì)胞穿過血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，經(jīng)局部抗原的再次刺激能夠分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子，招募外周循環(huán)中的T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)耳，擴(kuò)大免疫反應(yīng)，損傷內(nèi)耳組織[7]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過抑制過強(qiáng)的自身免疫反應(yīng)可對(duì)自身免疫性內(nèi)耳疾病大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用[7]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞能抑制調(diào)控免疫反應(yīng)，維持機(jī)體免疫耐受和免疫平衡，在防止變應(yīng)性疾病、自身免疫疾病及母胎免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11～13]?；诿纺岚２∶庖叻磻?yīng)學(xué)說，內(nèi)耳能夠接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答以及Treg細(xì)胞介導(dǎo)參與自身免疫性疾病的發(fā)展，本研究探討了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞與梅尼埃病發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果顯示梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比明顯降低，表明梅尼埃病患者免疫抑制減弱。

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在體內(nèi)主要通過TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮作用。TGF-β是誘導(dǎo)外周血CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，其能抑制免疫活性細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制淋巴細(xì)胞分化，是切斷免疫應(yīng)答的信號(hào)之一[14]。Treg細(xì)胞數(shù)量減少，機(jī)體代償機(jī)制促進(jìn)TGF-β分泌以調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)免疫抑制功能[15]；IL-10是重要的抗炎因子，主要由Foxp3+Treg細(xì)胞分泌，能夠抑制輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫病理學(xué)反應(yīng)，維持組織穩(wěn)態(tài)[16]。Treg細(xì)胞不同群體及其分泌的IL-10在維持免疫耐受方面具有重要意義，可提示疾病轉(zhuǎn)歸[17]。腺病毒介導(dǎo)的IL-10因子轉(zhuǎn)導(dǎo)入豚鼠內(nèi)耳并表達(dá)基因產(chǎn)物，可在一定程度上減輕內(nèi)耳組織免疫炎性損傷和聽力損傷[18]。此外，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞重要的調(diào)控基因，也是其重要的特異性標(biāo)志，對(duì)Treg細(xì)胞的生成及功能維持起著重要作用[19]。本研究檢測(cè)梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞相關(guān)因子發(fā)現(xiàn)，TGF-βmRNA相對(duì)表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3 mRNA和血清IL-10水平明顯降低；健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及相關(guān)因子表達(dá)優(yōu)于梅尼埃病緩解期，緩解期優(yōu)于發(fā)作期，且CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比與TGF-β、Foxp3、IL-10表達(dá)存在明顯的相關(guān)性，表明梅尼埃病患者處于免疫增強(qiáng)狀態(tài)，提示Treg細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)與梅尼埃病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及相關(guān)因子水平在不同聽力分期和單雙側(cè)梅尼埃病患者中無(wú)明顯差異，表明梅尼埃病患者Treg細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，印證了其本身即存在免疫抑制，可將Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子作為梅尼埃病免疫檢測(cè)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、Foxp3、IL-10異常表達(dá)，且與病情進(jìn)展程度關(guān)系密切，可能與患者體內(nèi)免疫抑制減弱有關(guān)。由Treg細(xì)胞調(diào)控的細(xì)胞免疫異?？赡苁敲纺岚２〉陌l(fā)病機(jī)制之一，然目前關(guān)于CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子與梅尼埃病的研究報(bào)道較少，其參與調(diào)控的機(jī)制還需后期進(jìn)一步的繼續(xù)探究分析。