鐘 琦,王紅旗,姜茹菡,肖雅倩,吳梟雄

共代謝條件下熒蒽降解菌的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

鐘 琦,王紅旗*,姜茹菡,肖雅倩,吳梟雄

(北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875)

以課題組篩選出的多環(huán)芳烴高效降解菌--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究對(duì)象,以熒蒽為目標(biāo)污染物,以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)為共代謝基質(zhì),基于同位素相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)比較細(xì)菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM培養(yǎng)基)和MSM-LB培養(yǎng)環(huán)境中降解熒蒽的全蛋白表達(dá)水平,旨在揭示蠟樣芽孢桿菌在共代謝過(guò)程中分子代謝水平上的變化.結(jié)果共檢測(cè)到64個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有28個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)36個(gè).鑒定到差異蛋白的功能集中在代謝、應(yīng)激反應(yīng)、信息傳遞和調(diào)控等方面,同時(shí)對(duì)比KEGG通路富集分析的結(jié)果,也顯示細(xì)菌有關(guān)能量代謝和信息傳遞、調(diào)控的通路產(chǎn)生的變化.比較細(xì)菌在是否處于共代謝下的差異蛋白表達(dá),推測(cè)細(xì)菌在降解多環(huán)芳烴過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是小分子代謝和適應(yīng)外界環(huán)境的通路.

共代謝；差異蛋白質(zhì)組學(xué)；多環(huán)芳烴；微生物降解；蛋白質(zhì)功能分析

多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)連在一起組成的一類有機(jī)化合物[1],廣泛存在于土壤、水體和大氣中.它們通常是由化石燃料和其他有機(jī)物質(zhì)的不完全燃燒形成的[2],具有“三致”效應(yīng)(致癌、致畸、致突變),被視作典型的持久性有機(jī)污染物[3].PAHs具有強(qiáng)疏水性,容易與土壤沉積物中的有機(jī)質(zhì)結(jié)合,與許多其他有機(jī)污染物相比難以降解[4].對(duì)于環(huán)境中的PAHs污染,常用的降解手段包括物理、化學(xué)和生物法[5],其中,生物法因具有無(wú)二次污染和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[3].根據(jù)目前研究報(bào)道,包括假單胞菌屬()[6]、紅球菌屬()[7]和芽孢桿菌屬()[8]等在內(nèi)的微生物已被證明具有良好的PAHs降解能力.

差異蛋白質(zhì)組學(xué),是研究?jī)蓚€(gè)或多個(gè)樣本在不同狀態(tài)或不同培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組變化,以分析重要生命過(guò)程,找出關(guān)鍵的不同蛋白質(zhì),作為定性和功能分析的標(biāo)志物[9].可以通過(guò)分析細(xì)菌在降解PAHs過(guò)程的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果,推測(cè)其降解途徑,有助于認(rèn)識(shí)細(xì)菌降解PAHs的機(jī)理.Mukherjee等[10]通過(guò)對(duì)銅綠假單胞菌() ASP-53菌株降解芘的過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),有關(guān)蛋白質(zhì)折疊(分子伴侶)、應(yīng)激反應(yīng)等功能的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),并鑒定出該細(xì)菌遵循水楊酸途徑降解芘.Yun等[11]研究了新鞘脂菌屬(sp.) US6-1菌株在降解PAHs時(shí)的蛋白質(zhì)組學(xué),發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌通過(guò)外二醇裂解途徑引導(dǎo)菲的代謝途徑.同時(shí)微生物降解PAHs的難易程度取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和降解酶的適應(yīng)程度[12].低環(huán)的PAHs(2～3環(huán))能夠被微生物以PAHs作為唯一碳源的方式有效的去除和修復(fù)[13],而四環(huán)或四環(huán)以上的PAHs一般以共代謝的方式被細(xì)菌降解[14].1963年Jensen[15]在共氧化[16]的基礎(chǔ)上提出了共代謝(co-metabolism)的概念,即在有其他碳源和能源存在的情況下,微生物能夠增強(qiáng)酶的活性,提高非生長(zhǎng)基質(zhì)的降解效率.前人的研究表明在加入共代謝基質(zhì)的情況下能夠提高細(xì)菌降解非生長(zhǎng)基質(zhì)PAHs的效率,并且有可能產(chǎn)生新的降解機(jī)制與途徑.Rentz等[17]研究用水楊酸和琥珀酸作為鞘氨醇單胞菌JAR02菌株(sp.)降解苯并[a]芘的共代謝基質(zhì),使得苯并[a]芘的降解率有所提高,并用HPLC/MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)能檢測(cè)出兩種新的中間產(chǎn)物.Juhasz[18]的研究指出在PAHs的混合體系中,低分子量PAHs的存在改善了五環(huán)和七環(huán)PAHs化合物的降解效果,混合體系中的苯并[a]芘和六苯并苯相對(duì)于它們作為唯一碳源的情況下,降解效率都有所提高.Wang等[19]發(fā)現(xiàn)一種假黃單胞菌屬細(xì)菌(sp.)可以在20mg/L的葡萄糖存在下在72h時(shí)降解超過(guò)95%的50mg/L的DDT.同時(shí),氮源的存在可能對(duì)共代謝過(guò)程也有著影響.Chaudhary等[20]分離出一株鏈霉菌屬(),在添加0.1%酵母提取物作為共底物的培養(yǎng)基中,對(duì)芴、菲進(jìn)行了降解行為研究,發(fā)現(xiàn)在100 μg/g的濃度下,該菌株在15d內(nèi)降解率可達(dá)92%和80%.Zhao等[21]的研究指出牛肉膏蛋白胨-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和玉米淀粉分別配制葡萄糖、甘油、尿素、氯化銨、蛋白胨等不同濃度的混合物可以作為降解實(shí)驗(yàn)的共代謝基質(zhì),并且發(fā)現(xiàn)氮源對(duì)地衣芽孢桿菌B-1共代謝高效氯氰菊酯也有著促進(jìn)作用[22].目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在共代謝條件下細(xì)菌對(duì)于復(fù)雜污染物降解效率的改變以及不同的因素(例如溫度和pH值等)對(duì)于微生物共代謝復(fù)雜污染物的影響[23-25]等.對(duì)于應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析細(xì)菌共代謝PAHs機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步發(fā)展.

為了科學(xué)地指導(dǎo)微生物在降解PAHs方面的應(yīng)用,提高微生物對(duì)PAHs的降解效率,了解細(xì)菌在共代謝過(guò)程中分子生物學(xué)水平上的變化,本研究以課題組篩選出的PAHs高效降解菌--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究對(duì)象,以熒蒽為目標(biāo)污染物,設(shè)置以LB培養(yǎng)基為共代謝基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)條件,比較細(xì)菌在LB+熒蒽和細(xì)菌將熒蒽作為唯一碳源條件下的差異蛋白表達(dá)結(jié)果,可以推斷出細(xì)菌在降解多環(huán)芳烴過(guò)程中的控速環(huán)節(jié).研究揭示了在一種新的共代謝條件下細(xì)菌的共代謝機(jī)制,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法研究細(xì)菌提升PAHs的降解效率的機(jī)制,為細(xì)菌更好地應(yīng)用于PAHs污染降解提供了參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基、溶液

主要藥品來(lái)源:熒蒽(分析純,美國(guó)J.T.Baker公司);丙酮(色譜純,美國(guó)J.T.Baker公司);乙腈,正己烷(色譜純,美國(guó)MREDE公司);NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、NaNO3等(分析純,天津福晨化學(xué)試劑有限公司);蛋白胨、酵母粉(分析純,北京奧博星生物有限責(zé)任公司).

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM培養(yǎng)基)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)的配制方法參考許潔等[26]的研究成果.

熒蒽儲(chǔ)備液:稱取熒蒽100mg,在棕色容量瓶中用丙酮定容至100mL,此時(shí)熒蒽濃度為1000mg/L,轉(zhuǎn)移到藍(lán)蓋瓶?jī)?nèi),纏上封口膜之后在通風(fēng)櫥內(nèi)保存.

以課題組前期從天津石油污染地區(qū)篩選得到的PAHs高效降解菌株--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究靶細(xì)菌.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將前期純化培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌的單克隆菌落放入高溫高壓滅菌后冷卻至常溫的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)箱的設(shè)置為溫度30℃,轉(zhuǎn)速110r/min,24h后蠟樣芽孢桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)期.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置 配置實(shí)驗(yàn)組MSM培養(yǎng)基,加入1g/L熒蒽儲(chǔ)備液,使MSM中熒蒽終濃度為100mg/L,蓋上封口膜之后在通風(fēng)櫥中靜置過(guò)夜,使丙酮揮發(fā)完全.

在MSM培養(yǎng)基、熒蒽-MSM和熒蒽-MSM+LB體系中加入倒掉培養(yǎng)基后經(jīng)PBS緩沖液洗滌3次的蠟樣芽孢桿菌,控制初始OD600值為0.4左右,放入溫度30℃,轉(zhuǎn)速110r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.以上所有操作均進(jìn)行3次平行重復(fù).

熒蒽-MSM體系是在20mL的MSM溶液中加入2μL的熒蒽儲(chǔ)備液,熒蒽-MSM+LB體系是在15mL的MSM溶液中加入5mL的LB培養(yǎng)基和2μL的熒蒽儲(chǔ)備液.

1.2.3 非靶向蛋白組學(xué)分析 蛋白提取、肽段酶解和iTRAQ標(biāo)記:將在MSM培養(yǎng)基、熒蒽-MSM 和熒蒽-MSM+LB體系中培養(yǎng)了24h的蠟樣芽孢桿菌離心后傾倒培養(yǎng)基,用PBS緩沖液洗滌3次,第1個(gè)作為后續(xù)的對(duì)照組菌體樣品,后2個(gè)作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)組菌體樣品.每個(gè)樣品都進(jìn)行3組的平行操作.

樣品采用SDT裂解法提取蛋白質(zhì);采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量;每份樣品取適量蛋白質(zhì)采用超濾管輔助樣本制備的(FASP)方法進(jìn)行胰蛋白酶酶解[27];然后用C18純化柱對(duì)酶解肽段進(jìn)行脫鹽,用40μL Dissolution buffer對(duì)凍干的肽段復(fù)溶,用OD280的值對(duì)肽段定量.接著分別取各樣品100μg肽段,按照AB SCIEX公司同位素相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記.

SCX色譜分級(jí):進(jìn)行初步分離,以降低每個(gè)組分中肽段樣品的復(fù)雜程度.將每組標(biāo)記后的肽段混合,采用AKTA Purifier 100進(jìn)行分級(jí).緩沖液A液為10mmol/L KH2PO4, 25% CAN, pH值 3.0, B液為10mmol/L KH2PO4, 500mmol/L KCl, 25%CAN, pH值3.0.色譜柱以A液平衡,樣品由進(jìn)樣器上樣到色譜柱進(jìn)行分離,流速為1mL/min.洗脫過(guò)程中監(jiān)測(cè)214nm的吸光度值,每隔1min需要收集洗脫組分,分別凍干后采用C18純化柱脫鹽.

樣品液相采集:每份分級(jí)樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離.緩沖液A液為體積濃度0.1%的甲酸水溶液,B液為體積濃度0.1%的甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%).色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣(上樣柱,Thermo Scientific公司Acclaim PepMap100, 100μm×2cm, nanoViper C18),經(jīng)過(guò)分析柱(Thermo Scientific公司 EASY column, 10cm, ID75μm, 3μm, C18-A2)分離,流速為300nL/min.

樣品質(zhì)譜檢測(cè):樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析.母離子掃描范圍為300～1800/,一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70000at 200/, AGC target 為1×106, Maximum IT為50ms,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60.0s.每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜.

蛋白質(zhì)分析:用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4對(duì)質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析.一級(jí)離子質(zhì)量容差為±0.002%;二級(jí)離子質(zhì)量容差為0.1Da;可信肽段篩選標(biāo)準(zhǔn)為￡0.01.蛋白質(zhì)比率按蛋白質(zhì)唯一的多肽的中位數(shù)計(jì)算,根據(jù)蛋白質(zhì)定量值的中位數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正.分別利用Blast2GO和KAAS軟件對(duì)檢測(cè)到的蛋白進(jìn)行GO注釋和KEGG注釋.

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

按照表達(dá)倍數(shù)變化1.2倍以上(上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83倍)且<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì),MSM-LB vs MSM組的上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)有28個(gè),下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)36個(gè),共有64個(gè).

針對(duì)蠟樣芽孢桿菌在MSM-LB和MSM實(shí)驗(yàn)組降解熒蒽過(guò)程中相比表達(dá)顯著差異的蛋白進(jìn)行詳細(xì)分析(表1).

表1 表達(dá)倍數(shù)變化大于1.2倍的差異蛋白的詳細(xì)情況

續(xù)表1

續(xù)表1

注:差異倍數(shù)表示蠟樣芽孢桿菌在MSM-LB和MSM實(shí)驗(yàn)組中差異表達(dá)蛋白的倍數(shù)之比,大于1表示上調(diào),小于1表示下調(diào);value表示假設(shè)檢驗(yàn)的值;蛋白功能是根據(jù)鑒定結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)而來(lái);功能描述是根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋或文獻(xiàn)報(bào)道得出.

咪唑甘油磷酸合成酶、核黃素ECF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、PTS纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白滲透酶都顯示出了非常顯著的上調(diào)表達(dá),說(shuō)明這些蛋白在細(xì)菌的共代謝行為中可能都起到了至關(guān)重要的作用;而L-乳酸脫氫酶3、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酸轉(zhuǎn)移酶、乙醇活性脫氫酶/乙醛活性還原酶均顯示出了下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),這些蛋白在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源時(shí)更加活躍.

2.2 差異表達(dá)蛋白的GO功能分析

表2 差異蛋白的GO功能分析

基因本體論GO(Gene Ontology)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的功能分類體系,提供動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)化詞匯表,并以生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)3個(gè)方面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性[39].使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢測(cè)到的差異蛋白進(jìn)行功能注釋分析,按照與GO功能分類相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目排序,分析結(jié)果如表2所示.

根據(jù)GO功能注釋結(jié)果,按照生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)方面進(jìn)行劃分.檢測(cè)到差異蛋白數(shù)量最多的生物過(guò)程是代謝過(guò)程,其次細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞代謝過(guò)程和有機(jī)物代謝過(guò)程也存在著15個(gè)以上的差異蛋白質(zhì).檢測(cè)到的差異蛋白數(shù)量最多的分子功能是催化活性,緊接其后的是轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合和氧化還原酶活性.細(xì)胞組分分類中,被檢測(cè)到的差異蛋白數(shù)最多的是組成細(xì)胞相關(guān)的蛋白,膜、膜部分和細(xì)胞部分等組分也都有著不少的差異蛋白存在.GO功能注釋為后續(xù)的蛋白具體功能分析提供了思路.

2.3 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析

圖1 差異蛋白KEGG通路分析TOP 20

橫坐標(biāo)表示顯著富集的KEGG通路;縱坐標(biāo)表示每條KEGG通路中包含的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目

在生物體中,需要不同蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)才能完成一系列生化反應(yīng)以行使其生物學(xué)功能.因此,通路分析能更系統(tǒng)、全面地了解細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程、性狀.KEGG是常用于通路研究的數(shù)據(jù)庫(kù)之一,它是由海量文獻(xiàn)中的信息整合而來(lái),以圖形語(yǔ)言描述眾多的代謝途徑以及各途徑之間的相互關(guān)系,收錄了新陳代謝、細(xì)胞過(guò)程等多個(gè)方面的通路信息[40].通過(guò)對(duì)顯著性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路注釋,能夠了解這些蛋白可能參與的代謝或信號(hào)通路.對(duì)MSM-LB vs MSM的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路富集分析,如圖1所示.丙酮酸代謝中檢測(cè)到的差異蛋白數(shù)量最多,為4個(gè);糖酵解/糖異生、丙酸代謝、丁酸代謝、雙組分系統(tǒng)等通路次之.

3 討論

通過(guò)對(duì)差異蛋白功能分析,發(fā)現(xiàn)在共代謝基質(zhì)存在的情況下,細(xì)菌與能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及信息傳遞、調(diào)控相關(guān)的蛋白都有上調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象.推測(cè)通過(guò)這些蛋白的高表達(dá),使得細(xì)菌在降解熒蒽的過(guò)程中能夠有特別的能量代謝途徑和信息傳遞與調(diào)控方式,更快適應(yīng)不良的碳源環(huán)境,從而能夠高效降解熒蒽.同時(shí)參與丙酮酸降解、丙酸降解、糖酵解通路、雙組分系統(tǒng)和趨化性的數(shù)個(gè)蛋白都有下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),推測(cè)這些通路只在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源時(shí)才得到更多的利用,是細(xì)菌以熒蒽為唯一碳源代謝時(shí)的關(guān)鍵途徑.

3.1 與代謝有關(guān)的差異蛋白

綜合分析64個(gè)差異表達(dá)的蛋白,其中有16個(gè)蛋白與代謝過(guò)程相關(guān).其中涉及到數(shù)個(gè)過(guò)程,如:能量的產(chǎn)生、糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、維生素和微量元素的轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、丙酮酸代謝、糖酵解等等.而細(xì)菌的代謝方式與是否處于共代謝環(huán)境下也有著關(guān)系.

咪唑甘油磷酸合成酶是由HisH(23kDa)和 HisF(28kDa)組成.HisH提供谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性,產(chǎn)生HisF合成咪唑甘油磷酸(IGP)和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖(AICAR)所必需的氨.Liu等[33]指出咪唑甘油磷酸合成酶參與組氨酸生物合成和細(xì)胞氮化合物代謝,為葡萄糖/脂肪酸合成提供碳框架,為細(xì)胞生命活動(dòng)和GY2B菌株降解菲提供能量,這說(shuō)明唑甘油磷酸合成酶在細(xì)胞的能量代謝等方面起著重要的作用.CitMHS家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)菌中負(fù)責(zé)金屬-檸檬酸鹽絡(luò)合物轉(zhuǎn)運(yùn)的二級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體[37].有學(xué)者認(rèn)為某些細(xì)菌利用金屬-檸檬酸鹽絡(luò)合物作為檸檬酸和金屬的來(lái)源[41].檸檬酸是一種弱有機(jī)酸,可以作為能量中間體和碳源[42],它是細(xì)胞三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,在能量代謝中起重要作用[43].磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)是細(xì)菌攝取己糖、己糖醇、二糖等糖類物質(zhì)的主要機(jī)制,它介導(dǎo)碳水化合物的攝取和磷酸化并控制代謝[44].磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)能夠特異性地結(jié)合某一種或幾種糖類,使相應(yīng)的糖類發(fā)生磷酸化,促進(jìn)糖的進(jìn)一步分解代謝[45].Houot等[46]的研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在LB培養(yǎng)基中能表達(dá)兩個(gè)額外的基于PTS的生物膜調(diào)節(jié)途徑,但在只添加0.5%(/)的葡萄糖或丙酮酸的最低培養(yǎng)基中卻不能表達(dá).本研究的結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)有著一定的吻合性,推測(cè)在設(shè)置的共代謝條件下,細(xì)胞因外部培養(yǎng)環(huán)境的改變而提升了PTS纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基IIC的表達(dá)水平,而這有利于細(xì)胞對(duì)于糖類的運(yùn)輸.3-羥基-5-膦酰氧基戊烷-2,4-二酮硫解酶其調(diào)控基因?yàn)長(zhǎng)srF,參與群體感應(yīng)信號(hào)自動(dòng)誘導(dǎo)劑-2 (AI-2)的調(diào)控,能夠催化乙酰基從P-HPD轉(zhuǎn)移到輔酶A,形成二羥基丙酮磷酸和乙酰輔酶A[34].乙酰輔酶A是代謝的重要中間產(chǎn)物,直接參與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)在內(nèi)的重要生命過(guò)程,可以釋放出能量用以ATP的合成[47].以上蛋白的高表達(dá)均指向細(xì)菌的能量代謝水平增加,推測(cè)是因?yàn)長(zhǎng)B培養(yǎng)基中的碳源更容易被細(xì)菌所利用,因此造成了能量代謝水平增長(zhǎng)的現(xiàn)象,進(jìn)而提高對(duì)于熒蒽的降解能力.

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)又被稱為ABC transporter,在原核及真核生物中都廣泛分布的一類超家族膜整合蛋白,能夠催化并利用ATP水解所產(chǎn)生的能量實(shí)現(xiàn)底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[32].ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白滲透酶是細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[48].氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶和蛋氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)滲透酶都屬于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的膜組分,其中如果缺乏蛋氨酸,就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成受阻[49].能量耦合因子型(ECF)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類新的ABC(ATP- binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在原核生物中負(fù)責(zé)維生素和微量元素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[29].核黃素又被稱為維生素B2,該物質(zhì)是多種酶反應(yīng)所需要的輔助因子前體[50],因此核黃素ECF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞的多種酶反應(yīng)中也都發(fā)揮著重要的作用,這些反應(yīng)可能直接或者間接的影響到了蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽的行為.這些高表達(dá)的蛋白都是涉及到細(xì)菌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,Buesen等[51]的研究指出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能與苯并[a]芘的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);孔德康等[52]也發(fā)現(xiàn)紅球菌BAP-1降解熒蒽時(shí)細(xì)胞膜上主要受影響的蛋白是與能量、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽的主要載體蛋白.因此在共代謝條件下,蠟樣芽孢桿菌對(duì)于熒蒽的攝取與運(yùn)輸可能更為活躍,使得細(xì)菌降解熒蒽的能力提高.

L-乳酸脫氫酶3、乳糖基谷胱甘肽裂解酶、乙醇活性脫氫酶/乙醛活性還原酶等蛋白參與到了細(xì)菌的丙酮酸代謝途徑之中,它們表現(xiàn)出的是下調(diào)的趨勢(shì).熒蒽的微生物降解途徑通常始于熒蒽芳香環(huán)上C-1,2、2,3、7,8或8,9位的雙加氧反應(yīng)[53],在苯環(huán)裂解雙加氧酶的作用下從而生成相對(duì)應(yīng)的二氫二醇熒蒽,再經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)逐步生成小分子芳香族化合物,如鄰苯二酚、原兒茶酸等,通過(guò)后續(xù)糖酵解、丙酮酸代謝最終進(jìn)入TCA循環(huán)[54].在共代謝基質(zhì)存在的情況下,相對(duì)來(lái)說(shuō)多環(huán)芳烴的降解通路的碳源利用效率較低,細(xì)菌可能會(huì)利用其它多條小分子代謝通路,但是在以熒蒽為唯一碳源的情況下,細(xì)菌對(duì)于降解熒蒽后續(xù)過(guò)程的小分子代謝可能主要利用丙酮酸代謝通路,造成丙酮酸代謝通路在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源情況下十分活躍.

值得注意的是Qin等[55]使用葡萄糖作為微桿菌屬(sp)M.CSW3菌株降解苯并[a]芘的共代謝基質(zhì),其蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明此種情況下抑制了糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá).這與本研究得出的結(jié)果相悖,推測(cè)可能是由于共代謝基質(zhì)的不同而造成的差異.這也可以作為今后相關(guān)研究的一個(gè)方向.

3.2 與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的差異蛋白

綜合分析64個(gè)差異表達(dá)的蛋白,其中有5個(gè)蛋白與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān).其中涉及到數(shù)個(gè)過(guò)程,如:應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生膜蛋白和產(chǎn)生孢子外殼蛋白等.

GlsB/YeaQ/YmgE家族應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白是一類存在于細(xì)胞膜上,因環(huán)境中的脅迫因素而應(yīng)激表達(dá)的蛋白.目前有報(bào)道指出GlsB/YeaQ/YmgE家族蛋白在環(huán)境適應(yīng)中出現(xiàn)高表達(dá)的情況.Li等[56]從青藏高原石油污染土壤中分離出枯草芽孢桿菌DM2,與枯草芽孢桿菌亞種相比,其全基因組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)了一些菌株特異性蛋白基因編碼,其中就有GlsB/ YeaQ/YmgE家族應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白,這些特異性蛋白反映了該菌株對(duì)惡劣條件和碳?xì)浠衔锢玫倪M(jìn)化適應(yīng)性.Goyal等[57]找到了一種高度耐受丁醇的松鼠葡萄球菌KM16,它在丁醇的脅迫下也能表達(dá)出GlsB/YeaQ/YmgE家族應(yīng)激反應(yīng)膜蛋白,這可能與該細(xì)菌的丁醇耐受性相關(guān).推測(cè)此蛋白可能是蠟樣芽孢桿菌存在利用熒蒽這一不良碳源的情況,進(jìn)而發(fā)生了應(yīng)激的高表達(dá)情況,以此幫助細(xì)菌適應(yīng)外部的生長(zhǎng)環(huán)境.同時(shí)還有數(shù)個(gè)孢子外殼蛋白的高表達(dá)情況存在,孢子會(huì)在環(huán)境攻擊的條件下產(chǎn)生在細(xì)菌中,營(yíng)養(yǎng)缺乏通常就會(huì)啟動(dòng)孢子的形成[58].孢子外殼蛋白能使得細(xì)菌對(duì)各種不良環(huán)境具有極強(qiáng)的抵抗力,包括高溫、干燥輻射和毒性物質(zhì)等[35].Wang等[59]對(duì)于熒蒽誘/導(dǎo)的紅球菌進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)孢子外殼蛋白在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的情況,認(rèn)為通過(guò)改變孢子外殼蛋白的表達(dá)水平,紅球菌可以適應(yīng)低碳環(huán)境并抵抗PAHs的毒性作用.Hong等[60]指出菌株HZ01在石油處理下,發(fā)生營(yíng)養(yǎng)饑餓和環(huán)境脅迫,編碼孢子外殼蛋白E的基因顯著上調(diào).因此推測(cè)孢子外殼的形成能幫助細(xì)菌應(yīng)對(duì)以熒蒽為唯一碳源時(shí)的挑戰(zhàn).相比于以熒蒽為唯一碳源時(shí),在共代謝基質(zhì)存在的情況下,細(xì)菌對(duì)于外部培養(yǎng)環(huán)境中熒蒽的刺激會(huì)表現(xiàn)的更加明顯,更多的表達(dá)出蛋白來(lái)適應(yīng)碳源的變化.

3.3 與信息傳遞、調(diào)控有關(guān)的差異蛋白

綜合分析64個(gè)差異表達(dá)的蛋白,其中有5個(gè)蛋白與信息傳遞、調(diào)控相關(guān).其中涉及到數(shù)個(gè)過(guò)程,如:轉(zhuǎn)錄信息的傳遞與調(diào)控、群體感應(yīng)過(guò)程的調(diào)控等.硝酸還原酶鉬輔因子組裝伴侶NarJ/NarW、反應(yīng)調(diào)節(jié)受體蛋白以及雙組分傳感器蛋白都呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì),它們參與過(guò)程主要涉及到細(xì)菌的雙組分系統(tǒng)和趨化性.

雙組分系統(tǒng)是原核生物和低等真核生物感知環(huán)境和內(nèi)部信息并做出反應(yīng)的相關(guān)蛋白質(zhì)機(jī)制,使得細(xì)胞能夠感知和處理信號(hào)[61].雙組分系統(tǒng)調(diào)控了細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖、營(yíng)養(yǎng)利用等多方面的過(guò)程,使得細(xì)菌能夠在不同的環(huán)境甚至逆境中生存[62].詹清[63]的研究發(fā)現(xiàn)新鞘氨醇桿菌US6-1菌株中的雙組分系統(tǒng)參與了降解苯并芘的調(diào)控過(guò)程.細(xì)菌趨化性是指細(xì)菌對(duì)有利環(huán)境的趨附行為和對(duì)有害環(huán)境的避離行為[64].Zaval'skii等[65]用光密度法和毛細(xì)管法研究發(fā)現(xiàn)兩株惡臭假單胞菌菌株對(duì)萘都有正趨化作用.

分析鑒定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)熒蒽作為唯一碳源時(shí),參與到蠟樣芽孢桿菌雙組分系統(tǒng)和趨化性通路中的蛋白表達(dá)量更高,而這些通路與熒蒽的降解也存在著緊密的聯(lián)系,暗示了這些通路所發(fā)揮的作用可能對(duì)于蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽起著重要的調(diào)控作用,也許是細(xì)菌為了利用碳源和能源而進(jìn)化出的優(yōu)勢(shì)選擇.

4 結(jié)論

4.1 本研究比較了蠟樣芽孢桿菌分別在MSM-LB和MSM培養(yǎng)基環(huán)境中降解熒蒽的全蛋白表達(dá)水平差異.以MSM-LB vs MSM變化1.2 倍以上(上調(diào)大于1.2 倍或者下調(diào)小于0.83 倍)且<0.05 的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì),共鑒定到64個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有28個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)36個(gè).

4.2 差異蛋白的功能集中在代謝、應(yīng)激反應(yīng)、信息傳遞和調(diào)控等方面,同時(shí)對(duì)比KEGG富集分析的結(jié)果,也顯示細(xì)菌有關(guān)能量代謝和信息傳遞、調(diào)控的通路產(chǎn)生的變化.

4.3 細(xì)菌在更容易利用LB中的碳源的情況下,將其作為生命能量來(lái)源的通路生理效率更高,相對(duì)來(lái)說(shuō)多環(huán)芳烴降解通路產(chǎn)生能量的效率較低.比較細(xì)菌在LB+熒蒽和細(xì)菌將熒蒽作為唯一碳源下的差異蛋白表達(dá),推測(cè)細(xì)菌在降解多環(huán)芳烴過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是丙酮酸代謝之類的小分子代謝通路和對(duì)外界環(huán)境作出反應(yīng)的雙組分系統(tǒng)和趨化性通路.因此進(jìn)一步的研究可以著重于相關(guān)通路中蛋白對(duì)于蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽的控速作用.

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Differential proteomic analysis of fluoranthene-degrading bacteria under co-metabolic conditions.

ZHONG Qi, WANG Hong-qi*, JIANG Ru-han, XIAO Ya-qian, WU Xiao-xiong

(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)., 2022,42(9)：4423～4432

The research object was thesp. DQ01, a highly effective Polycyclic Aromatic Hydrocarbons degrading bacteria screened by the research group. Fluoranthene and Luria-Bertani medium (LB medium) were used as the target pollutant and the co-metabolic substrate, respectively. The whole protein expression result of bacteria degrading fluoranthene in Minimal Salt Medium (MSM) and MSM-LB culture environment was compared with the isobaric tags for relative and absolute quantity (iTRAQ) technology to reveal changes in molecular metabolism level ofin the process of co-metabolism. In the results, a total of 64 differentially expressed proteins were detected, consisting of 28 up-regulated proteins and 36 down-regulated proteins. It was identified that the functions of differential proteins focused on metabolism, stress response, information transmission and regulation. At the same time, compared to the results from KEGG pathway enrichment analysis, the changes in bacterial pathways were thought to relate to energy metabolism, information transmission and regulation. Compared with the differential protein expression of bacteria under co-metabolism, the key link of bacteria in the process of degrading PAHs could be speculated to be the pathway of small molecule metabolism and adaptation to the external environment.

co-metabolism；comparative proteomic；PAHs；microbial degradation；protein functional analysis

X172

A

1000-6923(2022)09-4423-10

2022-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41772234)

*責(zé)任作者, 教授, amba@bnu.edu.cn

鐘 琦(1998-),男,安徽銅陵人,北京師范大學(xué)碩士研究生,主要從事污染土壤修復(fù)與治理研究.