陳曙冉，董 銳，吳華彰，劉牧林,△

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蚌埠 233000)

全球癌癥報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌已成為癌癥死亡的第二大常見原因，且發(fā)病年齡逐漸趨向于年輕化[1-3]。失去手術(shù)機(jī)會(huì)的結(jié)腸癌患者，在不進(jìn)行治療的情況下，平均壽命僅為8個(gè)月[4]?；熞褟V泛應(yīng)用于晚期結(jié)腸癌患者的治療，其中FOLFOX方案是目前結(jié)腸癌的臨床一線化療手段，該方案的化療用藥包括亞葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑[5-6]。然而由于耐藥的形成，即使經(jīng)過合理的治療，結(jié)腸癌患者5年生存率也相對較低[7-8]。因此，發(fā)現(xiàn)新的與FOLFOX化療方案耐藥的機(jī)制顯得格外重要。免疫治療在實(shí)體腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越大的作用[9-10]，多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)OLFOX化療方案對結(jié)腸癌患者體內(nèi)的免疫微環(huán)境有重塑作用[11-13]。為探究FOLFOX化療方案耐藥與免疫微環(huán)境的關(guān)系，本研究對FOLFOX化療方案敏感和耐藥的患者的表達(dá)譜進(jìn)行分析，基于隨機(jī)森林樹方法確定出耐藥的核心基因。使用耐藥基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，評估高低風(fēng)險(xiǎn)與免疫浸潤的關(guān)系，同時(shí)使用患者的臨床病理轉(zhuǎn)歸與預(yù)后進(jìn)一步探討免疫對FOLFOX化療患者的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載患者對FOLFOX化療方案有反應(yīng)情況的數(shù)據(jù)，使用“l(fā)imma包”和“sva包”將數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并，對差異最顯著的基因用熱圖進(jìn)行可視化。從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載結(jié)腸癌患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載含有患者生存狀態(tài)的數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1確定耐藥核心基因

使用“radomForest包”分析差異基因中最有意義的基因作為耐藥核心基因，在線網(wǎng)站Metascape對差異基因進(jìn)行功能富集分析。使用“l(fā)imma包”將患者按照耐藥核心基因的表達(dá)水平進(jìn)行聚類，使用“pheatmap包”對聚類結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.2分析耐藥相關(guān)基因與藥物敏感性和免疫微環(huán)境關(guān)系

基于耐藥核心基因的表達(dá)譜，采用共識(shí)聚類算法對結(jié)腸癌患者進(jìn)行分類，使用GSVA和ssGSEA分析耐藥相關(guān)基因不同亞型間的差異。從CellMiner網(wǎng)站(https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do)下載轉(zhuǎn)錄組和藥物敏感性數(shù)據(jù)。使用“imput包”補(bǔ)充藥物敏感性數(shù)據(jù)中的缺失值，使用ggpubr包和ggplot2包分析耐藥核心基因與藥物敏感性關(guān)系。

1.2.3構(gòu)建耐藥核心基因預(yù)后模型

將樣品分為train組和test組，使用train組樣品構(gòu)建預(yù)后模型，模型的公式為用于構(gòu)建模型基因的表達(dá)水平乘以其對應(yīng)的系數(shù)，隨后使用test組對所構(gòu)建的預(yù)后模型進(jìn)行驗(yàn)證。使用lasso回歸顯著基因構(gòu)建COX模型，根據(jù)基因表達(dá)水平及系數(shù)構(gòu)建模型公式從而計(jì)算test組中各樣品的風(fēng)險(xiǎn)得分。按風(fēng)險(xiǎn)得分中位值將樣品分為高低風(fēng)險(xiǎn)兩組，比較高低風(fēng)險(xiǎn)兩組的預(yù)后及受試者工作特征(ROC)曲線。使用test組驗(yàn)證train組構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性。

1.2.4風(fēng)險(xiǎn)得分與免疫微環(huán)境和耐藥

使用CIBERSORT算法計(jì)算每個(gè)結(jié)腸癌標(biāo)本中22個(gè)人免疫細(xì)胞亞群的分?jǐn)?shù)。此外，還使用單標(biāo)本基因集富集分析(ssGSEA)算法確定了結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤水平。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色

結(jié)腸癌組織與癌旁組織蠟塊取自2021年蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的4例結(jié)腸癌患者。將組織切片依次于二甲苯和無水乙醇浸泡，隨后使用乙醇和蒸餾水脫蠟并進(jìn)行封閉，4 ℃搖床過夜孵育一抗。磷酸鹽緩沖液洗去表面殘留一抗，并于二抗中室溫孵育1 h，用DAB顯色液對組織進(jìn)行顯色，最后脫水封片，分別在100×和200×視野下觀察并拍照。一抗FABP4、FOXC1及二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R4.1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗(yàn)生存差異；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 獲取結(jié)腸癌患者對FOLFOX化療方案耐藥相關(guān)基因

合并GSE28702和GSE69657數(shù)據(jù)集，對差異基因進(jìn)行GO富集分析，這些基因大多富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路。將免疫相關(guān)基因與本研究獲取的耐藥相關(guān)基因取交集，獲得127個(gè)免疫相關(guān)耐藥基因。使用隨機(jī)森林樹篩選耐藥核心基因，顯示耐藥核心基因的表達(dá)水平能明顯區(qū)分患者對FOLFOX化療方案的敏感性，見圖1。

2.2 耐藥相關(guān)基因分型及分型與免疫浸潤關(guān)系

采用共識(shí)聚類算法將結(jié)腸癌患者分為兩個(gè)亞型。PCA分析顯示，耐藥亞型能明顯將患者分為兩群。GSVA富集分析發(fā)現(xiàn)，不同分型下差異通路主要體現(xiàn)在免疫相關(guān)通路。ssGSEA分析表明，多數(shù)免疫細(xì)胞在分型B中的浸潤程度明顯高于分型A，見圖2。

A：耐藥相關(guān)差異基因的GO富集分析；B：耐藥相關(guān)差異基因與免疫相關(guān)基因的交集基因；C、D：隨機(jī)森林樹篩選耐藥相關(guān)核心基因；E：耐藥相關(guān)核心基因與患者對FOLFOX化療方案的反應(yīng)性關(guān)系。

A：耐藥相關(guān)核心基因分型；B：分型的PCA圖；C：分型間免疫細(xì)胞浸潤差異；D：分型間的功能差異。

2.3 耐藥相關(guān)基因與藥物敏感性關(guān)系

多數(shù)耐藥核心基因與FOLFOX4化療方案中的主要成分氟尿嘧啶和奧沙利鉑的敏感性具有相關(guān)性。此外，耐藥核心基因的表達(dá)水平與多種化療及靶向治療藥物的耐藥性存在正相關(guān)，見圖3。

2.4 耐藥基因分型的風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

LASSO-Cox回歸分析進(jìn)一步篩選候選預(yù)后相關(guān)的基因，生存分析表明高危組的總生存期明顯低于低危組，1、3和5年的曲線下面積(AUC)分別為0.840、0.801和0.736，見圖4。

A：耐藥相關(guān)基因與FOLFOX化療方案敏感性關(guān)系；B：耐藥相關(guān)基因與藥物敏感性關(guān)系。

2.5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型及臨床特征評估

單變量Cox回歸分析中，風(fēng)險(xiǎn)得分的HR=1.175，95%CI：1.130～1.222(P<0.001)；在多變量Cox回歸分析中，HR=1.103，95%CI：1.055～1.153(P<0.001)。隨著時(shí)間的增加，風(fēng)險(xiǎn)得分的一致性指數(shù)和ROC曲線表明風(fēng)險(xiǎn)模型比傳統(tǒng)臨床風(fēng)險(xiǎn)因素(TNM分期)在預(yù)測患者轉(zhuǎn)歸的能力上有更好的靈敏度和特異度。隨著腫瘤TNM分期的增高，患者風(fēng)險(xiǎn)得分也在增高。此外，在T分期為3～4期，N分期為1～2期及M分期為0期的患者中，高風(fēng)險(xiǎn)患者預(yù)后明顯較差，見圖5。

2.6 風(fēng)險(xiǎn)模型與結(jié)腸癌的免疫微環(huán)境

風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)與結(jié)腸癌患者免疫微環(huán)境中多種免疫細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等的浸潤程度密切相關(guān)。同時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)基因與PDCD1、CD274及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA4)這些免疫檢查點(diǎn)也具有共表達(dá)關(guān)系。此外，多數(shù)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平，如CD86、CD40及CD70等在高風(fēng)險(xiǎn)組患者表達(dá)增高。最后，HPA數(shù)據(jù)庫及患者標(biāo)本的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)更高，見圖6。

A：預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建；B～D：風(fēng)險(xiǎn)得分和患者生存狀況的散點(diǎn)排列圖，高危和低?；颊叻謩e用紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)表示；E：高低風(fēng)險(xiǎn)間總生存期的Kaplan-Meier分析；F：根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)得分預(yù)測1、3、5年生存率的靈敏度和特異度的ROC曲線。

A：臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)等級與OS的單變量和多變量分析；B：風(fēng)險(xiǎn)等級和臨床特征的一致性指標(biāo)；C：臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)等級的ROC曲線；D：風(fēng)險(xiǎn)等級與不同TNM分期的關(guān)系；E：不同臨床性狀在高低風(fēng)險(xiǎn)等級下的預(yù)后。

A：風(fēng)險(xiǎn)模型基因與免疫細(xì)胞含量的相關(guān)性；B：風(fēng)險(xiǎn)模型基因與免疫檢查點(diǎn)的共表達(dá)關(guān)系；C：高低風(fēng)險(xiǎn)組模型基因的表達(dá)；D：風(fēng)險(xiǎn)模型基因在結(jié)腸癌及癌旁組織的表達(dá)情況(DAB染色)。

3 討 論

FOLFOX化療方案是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者最常用的一線化療方案之一，但患者在經(jīng)該方案治療后客觀有效緩解率僅50%[14]?？紤]到化療本身對患者和社會(huì)帶來的巨大負(fù)擔(dān)，尋找能預(yù)測患者對FOLFOX化療方案靈敏的生物標(biāo)志物是一個(gè)十分重要且急需解決的問題[15]?；熕幬锏姆N類繁多，起到的作用也不盡相同。不同的化療藥物作用于不同種的腫瘤產(chǎn)生的耐藥機(jī)制也不同，而多藥耐藥是臨床上更加棘手的一個(gè)問題[16]。因此，本研究首先確定了結(jié)腸癌患者對FOLFOX4化療方案耐藥的關(guān)鍵基因，根據(jù)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平對樣品進(jìn)行分型，獲取分型的差異基因構(gòu)建結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)模型。結(jié)果顯示，該模型對患者的臨床病理特征及預(yù)后均具有較好的預(yù)測意義，且該模型與免疫微環(huán)境密切相關(guān)。

近來多項(xiàng)研究表明，化療聯(lián)合抗腫瘤免疫能大大提高對腫瘤的療效。游離氟尿嘧啶給藥同時(shí)聯(lián)合抗腫瘤免疫能明顯抑制原位結(jié)腸腺癌小鼠模型中腫瘤的生長[17]。一項(xiàng)臨床隨機(jī)Ⅱ期研究表明，在使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑同時(shí)加用細(xì)胞毒性藥物是治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的前期有效策略[18]。一項(xiàng)臨床回顧性研究表明，即使在免疫難治性微衛(wèi)星穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，化療前施用免疫檢查點(diǎn)抑制劑也可增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用[19]。這表明在化療同時(shí)輔以免疫治療能提高患者的化療效果，本研究確定的耐藥核心基因可能對化療聯(lián)合免疫治療的時(shí)機(jī)提供一定的指導(dǎo)意義。

免疫微環(huán)境包括多種免疫細(xì)胞及免疫因子[20]。目前，CTLA4在免疫治療中占據(jù)著越來越重要的作用[21-23]。最近一項(xiàng)成果也與本研究相互佐證[24]。此外，一項(xiàng)關(guān)于將抗CTLA4聯(lián)合FOLFOX治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者二期臨床研究也正在開展之中[25]。FOLFOX耐藥相關(guān)基因構(gòu)建的模型中CTLA4在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)降低，推測FOLFOX耐藥可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫狀態(tài)改變密切相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組與CD8+T細(xì)胞及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)。T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮了極其重要的作用，近年來嵌合抗原受體的T細(xì)胞治療方法讓血液系統(tǒng)惡性疾病患者受益匪淺，同時(shí)在實(shí)體腫瘤的治療上，該方案也發(fā)揮著越來越大的作用[26-28]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與腫瘤耐藥密切相關(guān)[29]，其能通過促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的分化，分泌多種細(xì)胞因子，甚至是物理因素等促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[30-32]。

綜上所述，T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的增高可能是高風(fēng)險(xiǎn)患者預(yù)后更差的原因。但本研究存在以下問題：(1)分析的數(shù)據(jù)中樣本量較少且均是回顧性數(shù)據(jù)，因此，需要更大樣本量、更詳細(xì)臨床數(shù)據(jù)及合理的前瞻性研究來驗(yàn)證。(2)未進(jìn)行較為詳盡的細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，因此，后期需要更詳盡的數(shù)據(jù)來佐證。