許花芬，馮 瓊，李春蕾

(海南省人民醫(yī)院海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院新生兒科，?？?570311)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)大多數(shù)發(fā)生于胎齡<32周的早產(chǎn)兒，其發(fā)病不利于早產(chǎn)兒預(yù)后[1-2]。尋找BPD早期標(biāo)志物進(jìn)行診斷并干預(yù)，有利于降低發(fā)病率和致殘率。微RNA(microRNA，miR)-29a可抑制靶基因mRNA翻譯，從而對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[3]。彈性蛋白(elastin，ELN)可為各血管壁細(xì)胞提供骨架結(jié)構(gòu)，與心血管疾病發(fā)生有關(guān)[4]。ZHONG等[5]研究顯示，BPD小鼠肺組織中miR-29a-3p表達(dá)上調(diào)，ELN表達(dá)下調(diào)，但目前仍缺少miR-29a-3p、ELN在BPD早產(chǎn)兒血清中的表達(dá)研究。因此，本研究通過檢測不同時(shí)間點(diǎn)血清miR-29a-3p、ELN的表達(dá)水平，探討二者在BPD早產(chǎn)兒中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年7月本院新生兒科收治的131例早產(chǎn)兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有BPD早產(chǎn)兒符合BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其診斷要點(diǎn)為：低出生體重，早產(chǎn)，超過21%的氧氣治療至少28 d或糾正胎齡36周仍需氧氣治療，伴有進(jìn)行性或持續(xù)性呼吸功能不全，有明顯肺部影像學(xué)表現(xiàn)；(2)胎齡≤32周、體重≤1 500 g，存活28 d以上者；(3)早產(chǎn)兒病歷資料齊全，研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)家長同意，并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他嚴(yán)重肺部疾病者；(2)有嚴(yán)重肺外感染者；(3)有先天性心臟病、先天性畸形、先天性代謝紊亂者。根據(jù)BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)將其分為BPD組(34例)和非BPD組(97例)。

1.2 方法

1.2.1資料采集

收集整理兩組胎齡、性別、出生體重、剖宮產(chǎn)、機(jī)械通氣時(shí)間、吸氧時(shí)間、最高氧濃度、院內(nèi)感染等一般資料。

1.2.2血清miR-29a-3p、ELN水平檢測

采集兩組早產(chǎn)兒出生后第1、7、14天靜脈血標(biāo)本，分離血清，保存?zhèn)溆?。采用RNA提取試劑盒(北京康瑞納生物科技有限公司)提取血清總RNA，檢測濃度后逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(定州百克賽斯生物科技有限公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為目標(biāo)cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-29a-3p水平，反應(yīng)體系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix(2×，上海翌圣生物科技股份有限公司)10 μL，Rox reference dye(50×，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)0.4 μL，無核酸酶的水6.0 μL。選用U6為內(nèi)參基因，采用2—ΔΔCT法計(jì)算血清miR-29a-3p相對表達(dá)水平。所用引物委托美國Invitrogen公司合成，miR-29a-3p上游引物5′-GTA TCC GGT GAG TCC AAG CGC-3′，下游引物5′-GCT AGA CAG ATC CCA GTA C-3′；U6上游引物5′-CAT GAT GCA CGG CAA AGC ATC-3′，下游引物5′-GTA ATT ACC CGT CTC CGT GTC-3′。采用ELISA法檢測血清ELN水平(試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

與非BPD組比較，BPD組機(jī)械通氣時(shí)間、吸氧時(shí)間更長，最高氧濃度、院內(nèi)感染率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

續(xù)表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清miR-29a-3p、ELN水平比較

早產(chǎn)兒出生后第7、14天，BPD組miR-29a-3p相對表達(dá)水平高于非BPD組，ELN低于非BPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著時(shí)間推移，BPD組miR-29a-3p相對表達(dá)水平逐漸上升，ELN水平逐漸下降，不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清miR-29a-3p、ELN水平比較

2.3 BPD組miR-29a-3p、ELN水平與一般資料的相關(guān)性

Pearson法及Spearman法分析結(jié)果顯示，BPD組早產(chǎn)兒出生后第7天miR-29a-3p與ELN水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且機(jī)械通氣時(shí)間、吸氧時(shí)間、最高氧濃度、院內(nèi)感染與miR-29a-3p呈正相關(guān)，與ELN呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖1、表3。

2.4 miR-29a-3p、ELN水平對早產(chǎn)兒BPD的預(yù)測價(jià)值

以是否發(fā)生BPD為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，早產(chǎn)兒出生后第7天miR-29a-3p、ELN及其聯(lián)合預(yù)測BPD發(fā)生的AUC分別為0.863(0.773，0.953)、0.878(0.819，0.937)、0.949(0.905，0.993)，且聯(lián)合預(yù)測AUC均大于miR-29a-3p、ELN單獨(dú)預(yù)測AUC(Z=1.687、1.908，P<0.05)，靈敏度分別為76.5%、82.4%、94.1%，特異度分別為89.7%、79.4%、86.6%，見圖2。

2.5 影響早產(chǎn)兒BPD發(fā)生的多因素logistic回歸分析

將早產(chǎn)兒是否發(fā)生BPD作為因變量，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-29a-3p、ELN是早產(chǎn)兒BPD發(fā)生的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表4。

圖1 BPD組miR-29a-3p與ELN水平相關(guān)性

表3 BPD組miR-29a-3p、ELN與一般資料的相關(guān)性分析

圖2 血清miR-29a-3p、ELN水平預(yù)測早產(chǎn)兒BPD的ROC曲線

表4 影響早產(chǎn)兒BPD發(fā)生的多因素logistic回歸分析

3 討 論

早產(chǎn)兒肺部慢性疾病BPD的發(fā)病率呈上升趨勢，且嚴(yán)重威脅早產(chǎn)兒生命安全[7]。研究顯示，機(jī)械通氣相關(guān)因素均是引起B(yǎng)PD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，機(jī)體長時(shí)間的高氧暴露，使體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肺組織的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常[8]。實(shí)現(xiàn)BPD早期預(yù)測是改善早產(chǎn)兒肺功能發(fā)育的重要前提。

miR已被證實(shí)與BPD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，miR-29家族的miR-29a下調(diào)可減輕BPD小鼠的肺損傷、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究結(jié)果顯示，隨時(shí)間推移，BPD早產(chǎn)兒血清miR-29a-3p水平逐漸上升，ELN水平逐漸下降，miR-29a-3p、ELN表達(dá)趨勢與ZHONG等[5]動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，HU等[3]研究中抑制miR-29a可減輕高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD，與本研究結(jié)果中miR-29a-3p與BPD的關(guān)系基本一致。推測本研究中血清miR-29a-3p水平上升后對靶基因ELN發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，抑制其翻譯成蛋白，使其在肺組織中的彈性支架作用減弱，造成肺部發(fā)育不良，推動(dòng)BPD的發(fā)生。此外，本研究相關(guān)性結(jié)果考慮可能是由于部分BPD早產(chǎn)兒出生后長時(shí)間暴露于機(jī)械通氣及高氧環(huán)境中，造成肺部反復(fù)感染，而肺部感染可能會(huì)引起血清miR-29a-3p表達(dá)水平升高，miR-29a-3p負(fù)調(diào)控ELN使其表達(dá)降低，影響肺部發(fā)育、造成肺損傷，而肺損傷又使吸氧時(shí)間、機(jī)械通氣時(shí)間延長，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)BPD的發(fā)生、發(fā)展。NDZI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，活動(dòng)性肺結(jié)核患者中hsa-miR-29a-3p明顯上調(diào)，進(jìn)一步證明了血清miR-29a-3p表達(dá)水平與肺部感染的關(guān)系。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-29a-3p、ELN聯(lián)合預(yù)測BPD的AUC、靈敏度有明顯升高。結(jié)合多因素分析結(jié)果，推斷血清miR-29a-3p、ELN表達(dá)水平的良好調(diào)節(jié)可能是預(yù)防及改善BPD發(fā)生、發(fā)展的新策略。DENG等[12]研究顯示，異常肺泡形成和過度紊亂的ELN積聚也可能是BPD的主要病理特征。表明ELN過度表達(dá)和積聚同樣不利于支氣管肺發(fā)育，今后仍需進(jìn)一步探究ELN在支氣管肺發(fā)育中的平衡狀態(tài)。

綜上所述，miR-29a-3p、ELN是BPD發(fā)生的影響因素，檢測早產(chǎn)兒血清miR-29a-3p、ELN表達(dá)水平可早期預(yù)測BPD發(fā)生。今后將擴(kuò)大樣本量，探究機(jī)械通氣、吸氧時(shí)間等是否影響miR-29a-3p、ELN表達(dá)水平。