郭旭瓊，李 碩，趙海燕，洪云川，馬 輝

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸內科，天津 300041)

肺癌中80%以上的患者為非小細胞肺癌，由于該病的發(fā)病比較隱匿，早期無明顯癥狀，絕大多數患者診斷時已經處于中晚期[1]。雖然術前的新輔助放化療能夠大大提高手術的切除率，但5年的生存率仍只有65%～80%，尤其是對于臨床分期Ⅲa以上的患者[2]，雖然在一定程度上改善了治療效果，但療效不是很明顯，可能與非小細胞肺癌生物學行為具有高度的侵襲性和轉移性相關[3]。非小細胞肺癌屬于異質性很強的惡性腫瘤，靶向治療研究成果改善了非小細胞肺癌的現狀，但患者的生存率提高仍不明顯，所以充分研究非小細胞肺癌的侵襲轉移機制，尋找診斷、治療和預后的相關分子標記物具有非常重要的意義?，F已發(fā)現超千種微RNA(microRNA，miRNA/miR)與人類的各種疾病息息相關[4]，其具有相對的穩(wěn)定性和基因表達調控特性，是未來生物標志物和潛在治療的靶點[5]。miRNA的表達水平變化與細胞的凋亡、分化、增殖等生物學過程有關，推測miRNA可能成為腫瘤啟動子或抑制劑及腫瘤診斷和預后的分子標志物[6]。因此，本研究將通過分析miR-429與卵泡抑素樣蛋白l(follistatin-like protein 1,FSTL1)基因的靶向關系，確定其對非小細胞肺癌預后和生物學功能的影響，為臨床非小細胞肺癌的治療及預后提供有價值的參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2021年6月本院行根治性切除術的60例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織(病灶處剪取直徑3～4 mm的組織塊)和癌旁組織(距離病灶5 cm剪取相應的組織塊)。收集的標本立即放入—80 ℃的液態(tài)氮中保存。納入標準：(1)患者未接受過放療、化療；(2)經病理學診斷確診為非小細胞肺癌患者；(3)根據國際癌癥聯合會(UICC)第八版的術后病理分期標準確定入組患者的病理結果。排除標準：(1)患者有嚴重的基礎性疾?。?2)合并其他惡性腫瘤的患者。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準并經過患者知情確認。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測miR-429的表達

將組織標本在液態(tài)氮中研磨，采用Trizol試劑盒提取組織和H1299細胞的總RNA，按照試劑盒的操作說明進行操作。并采用微量核酸定量光譜儀測定RNA的濃度和純度。使用invitrogen逆轉錄試劑盒superscriptⅢ進行逆轉錄操作。然后進行PCR擴增，建立擴增體系20 μL，于ABI 7900 qPCR儀上，按照反應條件95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，引物序列為miR-429上游5′-GAT AUG TAU CUT GCA UUG UTU-3′，下游5′-GAU TAG CAT CUG TUG UCG-3′；GAPDH作為內參，引物序列為上游5′-GAT AAG CAU CUT GUG TCG-3′，下游5′-AUT CTA ATU CTG CUT CAG U-3′，用相對定量2-ΔΔCT計算組織和細胞中miR-429表達水平，然后按照組織miR-429表達依據中位數法進行分組，分為miR-429高表達和低表達，分析患者的臨床特征和預后情況。

1.2.2細胞培養(yǎng)

采用10%胎牛血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)非小細胞肺癌細胞系SPCA1、A549、H460、H1299和正常肺支氣管上皮細胞BESA-2B，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.3細胞轉染和分組

細胞轉染參照LipofectamineTM2000試劑說明書上的步驟進行，將H1299細胞接種于6孔板中，當H1299細胞融合度達到80%左右時，將miR-NC、miR-429 mimics采用LipofectamineTM2000分別進行轉染作為miR-429 NC組、miR-429 mimics組，設置對照組，對照組H1299細胞不做任何處理。構建pcDNA-FSTL1的表達載體，應用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1-con和pcDNA-FSTL1分別轉染至高表達miR-429的H1299細胞中，作為miR-429 mimics+pcDNA3.1組和miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1組。轉染48 h后收集細胞，并進行后續(xù)實驗。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲

將Transwell上室中的8 μL Matrigel采用血清培養(yǎng)基進行稀釋，然后放入小室，37 ℃條件下孵育60 min，將500 μL的含10% FBS的完全培養(yǎng)基加入Transwell下室，將各組H1299細胞以5×104個/mL接種于上室，孵育24 h，取出Transwell上室，4%的多聚甲醛固定20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，風干，1%結晶紫染色30 min后，晾干，將聚碳酸酯膜放于載玻片中，封片，置于倒置顯微鏡下對細胞進行拍照計數。

1.2.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

將各組H1299細胞以2×106接種于6孔板中，待細胞融合，采用200 μL槍頭在中央區(qū)域畫一條橫線，更換培養(yǎng)基，去除劃下的細胞，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0、48 h取樣，拍照，計算遷移率，遷移率=(初始劃痕的寬度值-相應點的劃痕寬度值)/初始劃痕寬度值×100%。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗

通過Targetscan網站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-429在FSTL1 mRNA的3′-UTR處的潛在結合位點。從基因組DNA中擴增FSTL1的3′-UTR，并在FSTL1控制載體的終止密碼子下游克隆。該結構為野生型和突變型，使用位點定向誘變試劑盒進行PCR擴增，將熒光素酶報告載體與miR-429 NC和miR-429 mimics共轉染到H1299細胞中，48 h后雙熒光素酶分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 miR-429在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達情況

非小細胞肺癌組織miR-429相對表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)。非小細胞肺癌細胞系SPCA1、A549、H460、H1299中miR-429相對表達水平明顯低于正常肺支氣管上皮細胞BESA-2B(P<0.05)，其中H1299細胞表達最低，所以后續(xù)采用H1299細胞繼續(xù)實驗，見圖1。

A：miR-429在非小細胞肺癌組織和癌旁組織中的表達情況；B：miR-429在不同非小細胞肺癌細胞系及正常肺支氣管上皮細胞中的表達情況；a：P<0.05，與癌旁組織比較；b：P<0.05，與BESA-2B比較。

2.2 miR-429表達與患者臨床特征的相關性分析

miR-429高表達和低表達患者的腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 miR-429表達與患者臨床特征的相關性分析[n=30,n(%)]

2.3 miR-429表達對非小細胞肺癌患者預后的影響

Kaplan-Meier和Log-rank檢驗結果顯示，miR-429高表達患者中位生存時間為49個月，miR-429低表達患者為37個月，miR-429高表達患者的生存率明顯優(yōu)于低表達患者(Log-rankχ2=6.915，P=0.019)，見圖2。

圖2 miR-429表達與非小細胞肺癌患者總體生存相關性

2.4 miR-429對H1299細胞侵襲的影響

對照組和miR-429 NC組H1299細胞侵襲數量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),miR-429 mimics組H1299細胞侵襲數量明顯低于對照組和miR-429 NC組(P<0.05)，見圖3。

2.5 miR-429對H1299細胞遷移的影響

對照組和miR-429 NC組H1299細胞的愈合能力比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),miR-429 mimics組H1299細胞的愈合能力明顯低于對照組和miR-429 NC組(P<0.05)，見圖4。

A：細胞侵襲檢測圖(Transwell，200×)；B：轉染后穿膜細胞侵襲數量柱狀圖；a：P<0.05，與對照組和miR-429 NC組比較。

A：細胞遷移檢測圖(50×)；B：轉染后細胞愈合率柱狀圖；a：P<0.05，與對照組和miR-429 NC組比較。

2.6 miR-429靶向FSTL1關系

TargetScan網站發(fā)現了FSTL1的3′-UTR區(qū)域具有miR-429的靶向結合位點，熒光素酶報告結果顯示，與miR-429 NC組比較，miR-429 mimics組野生型FSTL1報告基因的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，但突變型的熒光素酶活性并沒有發(fā)生改變(P>0.05)，見圖5。

2.7 miR-429靶向FSTL1對H1299細胞侵襲和遷移的影響

miR-429 mimics組H1299細胞侵襲數量和愈合率明顯低于對照組(P<0.05)；miR-429 mimics組和miR-429 mimics+pcDNA3.1組H1299細胞侵襲數量和愈合率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1組H1299細胞侵襲數量和愈合率明顯高于miR-429 mimics組(P<0.05)，見圖6。

A：miR-429靶向FSTL1關系；B：雙熒光素酶報告基因試驗證實靶向關系;a:P<0.05，與miR-429 NC組比較。

A、B:細胞侵襲檢測圖(Transwell,200×)及定量分析；C、D：細胞遷移檢測圖(50×)及定量分析；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與miR-429 mimics組比較。

3 討 論

肺癌根據病理分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌是癌變所導致死亡的最主要原因[7]。非小細胞肺癌的發(fā)病原因還尚不明確，多數研究表明環(huán)境、吸煙、遺傳因素、職業(yè)接觸及慢性肺部感染是發(fā)病的危險因素[8]。由于該病臨床表現缺乏特異性，一些患者確診時已為晚期，失去了最佳治療的時間，雖然手術、放化療、分子靶向治療等多項治療手段已經取得了重大的突破，但非小細胞肺癌的5年總生存率也僅為15%左右[9]。非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多種基因參與的復雜的生物學過程，相關研究發(fā)現，腫瘤基因、腫瘤生長因子、細胞的侵襲和遷移等在非小細胞肺癌的治療和預后起著重要的作用[10]。

miRNA對基因翻譯有著非常大的影響，人類基因中50%以上是由miRNA調控的[11]。另外每個miRNA可以調節(jié)大量的靶基因，通過miRNA靶基因的調節(jié)形成一個相互作用復雜的網絡，允許miRNA調控細胞的全面活動，包括細胞的增殖、凋亡、細胞周期、侵襲、遷移及血管的形成[12]。miRNA廣泛參與人類的各種疾病，包括腫瘤。在不同的腫瘤中，miRNA已經被證明是早期診斷和預后的潛在標記物。miR-429屬于miR-200家族的成員之一，是具有抑癌作用的miRNA，該家族具有高度保守性及組織特異性等生物學特征[13]。最新研究報道，miR-429在幾種腫瘤中的表達降低，發(fā)揮著抑癌作用，可以作為早期檢測和預后的分子標記物[14]。FSTL1基因定位于3q13染色體，屬于一種分泌性糖蛋白，由308個氨基酸組成[15]。近年來，關于FSTL1基因的研究主要集中在自身免疫性疾病、免疫調節(jié)、炎癥和缺血后血管重構，鑒于FSTL1基因在炎癥中發(fā)揮著特殊的作用[16]，所以在腫瘤的發(fā)展中引起了研究者的興趣。相關研究發(fā)現，FSTL1基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮著雙重調控的作用[17]，但確切的機制尚不明確，所以本研究探討miR-429對非小細胞肺癌預后和生物學功能的影響及對FSTL1基因的調控機制，結果發(fā)現miR-429對非小細胞癌的早期診斷和預后起到至關重要的作用。

本研究首先通過實時熒光定量PCR檢測miR-429的表達，結果顯示miR-429在非小細胞肺癌組織和細胞系中高表達，且miR-429表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期具有一定的關系，且miR-429高表達患者的生存率明顯優(yōu)于低表達患者。為了驗證miR-429在非小細胞肺癌中的作用，采用Transwell和細胞劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移，結果顯示，高表達miR-429可以抑制H1299細胞的侵襲和遷移。隨后通過Targetscan網站預測miR-429在FSTL1 mRNA的3′-UTR處的潛在結合位點，并通過雙熒光素酶報告實驗證明，miR-429 mimics組野生型FSTL1報告基因的熒光素酶活性明顯降低。接著構建pcDNA-FSTL1的表達載體，經pcDNA-FSTL1轉染到高表達miR-429的H1299細胞中，結果顯示，miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1組中H1299細胞侵襲數量和愈合率高于miR-429 mimics組。提示高表達miR-429可以促進FSTL1的表達，從而起到抑制細胞侵襲和遷移的作用。相關研究表明，高表達miR-429可以誘導非小細胞肺癌A549細胞株的增殖、侵襲和轉移，并靶向RASSF8、PTEN等基因調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]，與本研究類似。

綜上所述，本研究初步探討了miR-429在非小細胞肺癌中的作用，驗證了miR-429靶向FSTL1關系，通過靶向FSTL1基因調控非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移的作用，為非小細胞肺癌的分子靶向治療提供有價值的參考。