趙 娜，史永志，曹 賢，肖 音，韓曉燕，牛藝璇，肖 斌（.鄂爾多斯市中心醫(yī)院臨床藥學實驗室，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 07000；.鄂爾多斯市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 07000；.鄂爾多斯市中心醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯07000；.?？谑腥嗣襻t(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院，海南 ?？?57008）

癲癇屬于慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前預防癲癇發(fā)作的基本手段是藥物治療，目標是在無明顯不良反應前提下完全控制癲癇發(fā)作[1]，大部分癲癇患者需要長期甚至終身服藥[2]，不少患者需同時服用兩種或兩種以上抗癲癇藥物。傳統(tǒng)觀念認為治療效果與藥物劑量直接相關(guān)，但許多臨床實踐證明劑量與療效之間并不完全平行，存在明顯的“化學上等價而生物學上不等價”現(xiàn)象。抗癲癇藥物體內(nèi)代謝大多呈非線性藥動學特點、藥物間相互作用復雜，難以通過藥效學指標來確定最佳劑量，因此治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）就顯得尤為重要。TDM是將藥代動力學原理與血藥濃度監(jiān)測相結(jié)合，指導臨床合理用藥[3-4]?？R西平（carbamazepine，CBZ）、苯巴比妥（phenobarbital，PB）、苯妥英鈉（phenytoin sodium，PHT）、拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）是臨床中常用的抗癲癇藥物，筆者采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立同時測定人血清中上述4種藥物的濃度方法，旨為臨床治療提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀（日本島津公司）、雅培ARCHITECT i1000sr全自動免疫分析儀（美國雅培公司）、HMS-350小型漩渦振蕩器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、 GM-1.0A隔膜真空泵（天津津騰實驗設備有限公司）、KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、PRACTUM5101-1CN分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

CBZ對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmhH，批號：CDCT-C10968500，含量：99.5%），PB對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171222-201206，含量：99.7%），PHT對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100210-201303，含量：99.0%），LTG對照品（加拿大Toronto Research Chemicals lnc，批號：CDDML173250-50mg，含量：98.0%），甲醇（天津市康科德科技有限公司，批號：2019MH007，HPLC色譜純，含量：99.9%），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與血清樣品預處理

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（44∶56），柱溫：37 ℃，檢測波長：218 nm，流速：0.9 mL·min-1，進樣量：20 μL，全自動進樣。精密量取空白血清200 μL，置5 mL離心管，加甲醇600 μL作為蛋白沉淀劑，渦旋振蕩2 min，15 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，經(jīng)孔徑0.22 μm有機微孔濾膜過濾2次，取20 μL進樣分析。

2.2 試液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備精密稱取CBZ、PB、PHT和LTG各對照品適量，甲醇溶解并定容至25 mL量瓶，配制成濃度為1.0、5.0、1.0、1.0 mg·mL-1的儲備液，分別用移液槍精密移取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成標準系列濃度，置– 20 ℃冰箱保存。

2.2.2 標準血樣的制備取上述CBZ、PB、PHT和LTG的標準系列濃度儲備液，加入適量空白血清，配成CBZ 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0 μg·mL-1，PB 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·mL-1，PHT 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0 μg·mL-1，LTG 0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1的系列濃度混合標準血樣。

2.3 患者血樣的獲取

采集服用此類藥物的癲癇患者血清樣本，嚴格控制在藥物達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度后（一般為給藥后5 ～ 6個半衰期）[3]的谷濃度時采血，即下一周期給藥前。取靜脈血2 ～ 3 mL于黃色生化采血管，盡快送檢。

2.4 實驗方法

2.4.1 化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）依據(jù)雅培ARCHITECT i1000sr全自動免疫分析儀的標準操作規(guī)范測定血藥濃度。測定每批次樣本時，用質(zhì)控樣品進行平行測定，若質(zhì)控樣本超出標示范圍，校正標準曲線，并于當日測定患者血清樣本濃度。

2.4.2 HPLC法采用“2.1”項下建立的測定方法學，使用高、中、低濃度質(zhì)控樣本平行測定，測定值RSD＜ 15%，最低檢測限RSD ＜ 20%，以保證同一分析批次測定值準確性，于當日測定患者血清樣本濃度。

2.5 結(jié)果

2.5.1 專屬性實驗由圖1可知，血清中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾同時測定CBZ、PB、PHT以及LTG血藥濃度。CBZ、PB、PHT、LTG保留時間分別為27.6、10.4、22.4、8.6 min，四者分離度良好。

圖1 HPLC色譜圖A – 空白血清，B – 血清樣本，C – LTG對照品，D – PB對照品，E – PHT對照品，F(xiàn) – CBZ對照品；1 – 拉莫三嗪，2 – 苯巴比妥，3 – 苯妥英鈉，4 – 卡馬西平Fig 1 HPLC chromatogramA – blank serum, B – serum samples, C – LTG reference substance, , D – PB reference substance, E – PHT reference substance, F – CBZ reference substance; 1 – LTG, 2 – PB, 3 – PHT, 4 – CBZ

2.5.2 線性關(guān)系及最低檢測限分別精密量取CBZ、PB、PHT和LTG對照品系列濃度儲備液各20 μL，加入空白血清120 μL，配制成系列標準血樣濃度，按照“2.1”項下方法沉淀蛋白，以被監(jiān)測藥物對應的峰面積Y與相應濃度X進行線性回歸，見表1。

表1 4種抗癲癇藥物線性范圍、標準曲線、相關(guān)系數(shù)和最低檢測限Tab 1 Linear range, standard curve, correlation coefficient and minimum detection limit of the 4 antiepileptic drugs

2.5.3 精密度與回收率實驗空白血清加入適量系列標準品儲備液，制成含4種抗癲癇藥物的低、中、高濃度標準血清樣本溶液各5份，按“2.1”項下方法處理，所得樣本溶液分別連續(xù)進樣分析；在不同天內(nèi)分別制備低、中、高5批樣本，每個樣本連續(xù)進樣5次并連續(xù)進樣5 d；分別考察相對回收率及日內(nèi)、日間精密度。檢測結(jié)果均符合方法學要求，見表2。

表2 CBZ、PB、PHT、LTG精密度和回收率. n = 5Tab 2 Precision and recovery of CBZ, PB, PHT and LTG. n = 5

2.5.4 穩(wěn)定性實驗分別考察4種抗癲癇藥物低、中、高濃度質(zhì)控樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品在室溫放置0、2、4 h，–4 ℃保存12 h，–20 ℃保存一周并反復凍融3次，含藥血清樣本穩(wěn)定性良好。見表3。

表3 CBZ、PB、PHT、LTG穩(wěn)定性考察Tab 3 Stability investigation of CBZ, PB, PHT and LTG

2.6 臨床應用及檢測方法對比分析

筆者采集了24例使用CBZ的癲癇患者血清標本，分別采用HPLC法與CLIA法測定，詳見表4。使用SPSS 17.0和MedCalc 19.1.3統(tǒng)計軟件進行分析。兩種方法CBZ測定值經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗均近似正態(tài)分布；二者相關(guān)系數(shù)r= 0.955，經(jīng)雙側(cè)Pearson檢驗，P＜ 0.001，差異有統(tǒng)計學意義，可見使用免疫法與色譜法檢驗的結(jié)果高度相關(guān)；經(jīng)F顯著性檢驗，F(xiàn)=228.411，P＜ 0.001，差異有統(tǒng)計學意義，即此回歸方程可建立，回歸方程為Y= 1.371 + 0.856X，r= 0.912。

表4 使用CBZ患者的血藥濃度分析. mg·L-1Tab 4 Analysis of blood concentration of patients with CBZ. mg·L-1

進一步考察兩種方法檢測結(jié)果差異，首先對所得數(shù)據(jù)進行配對t檢驗分析，兩種方法測定值間差異有統(tǒng)計學意義（t= 3.216，P＜ 0.01）。Bland-Altman偏差分析顯示，兩種方法測定值RE絕大多數(shù)為正偏差，平均值0.64%（95%CI：–1.27% ～ 2.56%）。上述結(jié)果均說明CLIA法與HPLC法檢測值差異有統(tǒng)計學意義，且CLIA法檢測值稍高于HPLC法檢測值。朱旭等[5]研究熒光偏振免疫（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）法檢測值顯著高于HPLC法，可見CLIA法與HPLC法檢測結(jié)果較FPIA接近。免疫法檢測值高于HPLC法，初步考慮可能由于CBZ的活性代謝產(chǎn)物10,11-環(huán)氧卡馬西平的化學結(jié)構(gòu)與原藥相似，且有著類似的抗原表區(qū)，均可發(fā)生抗原抗體反應，采用免疫法較難將其完全分開，從而導致檢測藥物濃度與實際濃度存在一定偏差[5-7]。但由于樣本量有限需要在臨床上繼續(xù)收集大量樣本進行深入研究。

3 討論

3.1 抗癲癇藥物濃度監(jiān)測的必要性

目前全球癲癇患者約5000萬例，我國癲癇患者約有1000萬例，且以每年45萬例的速度增長[8]。盡管新型抗癲癇藥物不斷涌現(xiàn)，但是我國仍有25%患者因未能實施個體化用藥指導，導致癲癇控制不理想[9]。CBZ、PB、PHT為傳統(tǒng)抗癲癇藥物，治療窗窄且為肝藥酶誘導劑，藥物代謝易受基因多態(tài)性的影響[10]，藥物間相互作用較復雜，又具有非線性藥動學特點，利用藥效學指標較難制定個體化用藥方案。因此在臨床使用中傳統(tǒng)抗癲癇藥物均應開展TDM[11-13]。LTG屬于新型抗癲癇藥物，此類藥物安全性較傳統(tǒng)藥物高[14]，研究[15-17]表明，雖然LTG安全性較高，但其體內(nèi)藥動學較復雜，且受年齡、性別、體重、合并用藥、特殊生理狀態(tài)及葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶影響[18]，因此達到有效血藥濃度所需劑量個體差異也較大，有必要進行TDM[19-20]。筆者選用HPLC法建立同時監(jiān)測臨床常用傳統(tǒng)抗癲癇藥物與新型抗癲癇藥物濃度的方法學，檢測成本較低，且有助于進一步研究藥物間相互作用，更深入指導臨床合理用藥，還可為藥物濫用以及藥動學研究提供科學思路與依據(jù)。

3.2 生物樣品預處理技術(shù)選擇與考察

血藥濃度檢測中，生物樣本預處理常用方法有提取法和蛋白沉淀法。提取法中液-液萃取法應用較多，其優(yōu)點在于其較強選擇性，一定程度上可以保護色譜柱，缺點是容易發(fā)生乳化，引起藥物損失，而且操作復雜耗時[21]。筆者曾嘗試使用二氯甲烷、正己烷等作為提取劑，發(fā)現(xiàn)在渦旋振蕩時易發(fā)生乳化，故最終選用蛋白沉淀法，該方法簡便、快速，滿足臨床血藥濃度監(jiān)測需要[22]。常見的蛋白沉淀劑是乙腈和甲醇。有研究表明當含藥的血清或血漿與水性有機溶劑的體積比為1∶（1 ～ 30）時，可以將90%以上蛋白質(zhì)去除[23]，故選用血清:甲醇=1∶3比例，此條件下可去除95%以上蛋白質(zhì)[23]。樣品離心后取上清液經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾2次，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)處理后樣品干擾較少。

3.3 檢測波長及流動相考察

通過查閱2020年版《中華人民共和國藥典》發(fā)現(xiàn)，在各自適宜條件下，CBZ在238 nm與285 nm波長處有最大吸收；PB吸收波長220 nm；PHT在248 nm波長處存在最大吸收；LTG最大吸收峰在波長（306±2）nm。筆者分別考察了210、215、218、220、240 nm等波長，經(jīng)比較，在218 nm處內(nèi)源性物質(zhì)干擾較小，且LTG信號響應較強，有利于濃度較低的LTG檢出。文獻[24-25]使用的流動相中均含無機鹽或酸，以及梯度洗脫分析，平衡系統(tǒng)和檢出后色譜柱沖洗時間較長，干擾因素較多，不利于色譜柱保護，實際操作較繁瑣。因此，筆者考察了甲醇-水系統(tǒng)與乙腈-水系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)二者分離效果相當，乙腈-水系統(tǒng)柱壓雖較小，但藥物保留時間長于甲醇-水系統(tǒng)，綜合考慮各方面因素，筆者選用甲醇-水（44∶56）為流動相。此色譜條件下，上述4種抗癲癇藥物可以很好分離，不受血清內(nèi)源性物質(zhì)干擾，各藥物峰型良好，符合方法學要求。

3.4 HPLC法與免疫法在TDM中的對比分析

當前關(guān)于血藥濃度監(jiān)測，HPLC法與免疫法在國內(nèi)外的醫(yī)院都得到了廣泛的應用。HPLC-MS、UHPLC-MS/MS等應用較多，但由于儀器價格較高，在基層醫(yī)院具有一定局限性。以往抗癲癇藥物濃度監(jiān)測多針對方法學建立[4]，少部分學者建立了監(jiān)測卡馬西平濃度的HPLC法，并與FPIA法進行比較[5,26]。但此類研究僅針對早期FPIA與HPLC法之間的差異，對于CLIA法與HPLC法之間的差異性研究較少。因此筆者建立了同時監(jiān)測4種抗癲癇藥物的方法學，并收集24例使用CBZ的患者血清樣本，分別采用HPLC法與CLIA法檢測，結(jié)果顯示CLIA法與HPLC法的檢測結(jié)果較FPIA接近，CLIA法檢測值稍高于HPLC法檢測值，但由于樣本量較少，需擴充臨床樣本量進一步驗證。

綜上，本研究中建立的同時監(jiān)測4種抗癲癇藥物的方法靈敏度、精密度、準確性均較高，操作簡便，臨床應用成本較低，HPLC法與免疫法各具優(yōu)缺點，可以根據(jù)臨床需求以及本單位實際情況選擇適宜的方法應用。