李建華 張智明 何世岷 竇海燕 方 超 劉 旭

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

1 病毒的培養(yǎng)與純化

1.1 分離與培養(yǎng)

將處理好的病料溶液過濾后，按0.2 mL/胚的量接種10日齡SPF雞胚，接種后的雞胚置于35℃專用恒溫孵化箱中(濕度保持為60%～65%)培養(yǎng)，每日檢查2次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集24 h后死亡雞胚的尿囊液。培養(yǎng)72 h結(jié)束，取出剩余存活雞胚，4℃冰箱保存12 h，收取雞胚液，立即進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗。其中，有1份病料在盲傳第2代接種時，得到的雞胚尿囊液可見明顯的紅細(xì)胞凝集，效價為1∶128，對雞胚進(jìn)行解剖，胚體出現(xiàn)了水腫和出血點等病理變化，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 正常對照雞胚

圖2 接種H1N1病毒的雞胚

1.2 病毒的克隆與純化

依據(jù)有限稀釋的方法對分離株病毒進(jìn)行純化，用生理鹽水將血凝陽性的尿囊液稀釋成10-4、10-5、10-6和10-7等4個梯度，每個梯度分別接種5枚10日齡的雞胚傳代純化，每次乃對陽性樣品中最高稀釋度的單胚尿囊液進(jìn)行收集，用于下一次的傳代，連續(xù)接種3代后收獲存活時間穩(wěn)定在72 h左右且雞紅細(xì)胞凝集價穩(wěn)定在1∶512的雞胚。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織在1980年通過的流感病毒毒株命名法修正案，將純化后的病毒，命名為A/swine/SuiHua/6/2015(H1N1)，簡稱豬流感病毒H1N1亞型SH株。

2 病毒的鑒定

2.1 雞胚半數(shù)感染量 （EID50）的測定

用PBS溶液將病毒液稀釋成10-4、10-5、10-6和10-7的濃度，各稀釋度分別接種6枚雞胚，每枚雞胚0.1 mL，分別收獲雞胚尿囊液，測定其對雞紅細(xì)胞凝集價≥1∶16為感染；對雞紅細(xì)胞凝集價＜1∶16為未感染，結(jié)果顯示當(dāng)稀釋度為10-4、10-5時接種雞胚感染率可達(dá)100%，當(dāng)稀釋度為10-6時接種雞胚感染率為71%，當(dāng)稀釋度為10-7時接種雞胚感染率為13%。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，按照Reed-Muench測定其病毒液的病毒含量(EID50)，通過計算得到分離毒株的病毒含量為107.36EID50/0.1 mL。

表1 病毒EID50測定結(jié)果

2.2 病毒的血清學(xué)鑒定

將純化得到的病毒株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，可知分離株的病毒對豬流感病毒H1亞型特異性抗血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；對豬流感病毒的H3、H5以及H9亞型單特異性抗血清檢測結(jié)果為陰性反應(yīng)，結(jié)果詳見表3，表明所得的分離株為H1亞型豬流感病毒。

表2 紅細(xì)胞凝集抑制試驗 （HI）鑒定結(jié)果

表3 病毒血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗結(jié)果

2.3 病毒的電鏡鑒定

委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室對病毒進(jìn)行電鏡鑒定。由圖3可知，分離到的病毒株具有典型流感病毒的基本特征：病毒粒子直徑在80～120 nm，具有囊膜，同時其表面可見較多放射狀的突起，也就是纖突和刺突。與常見的流感病毒的形態(tài)大體一致。

圖3 電鏡觀察到的豬流感分離株

2.4 分離病毒的RT-PCR檢測

利用設(shè)計的擴(kuò)增引物對所分離出的豬流感毒株進(jìn)行亞型鑒定。在瓊脂糖凝膠電泳的膠圖4、圖5可見僅H1 U/L和N1 U/L擴(kuò)增出了與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致的陽性條帶，可以確定此分離病毒的HA是H1亞型，NA是N1亞型。

圖4 豬流感H1、H3分型鑒定結(jié)果

圖5 豬流感N1、N2分型鑒定結(jié)果

將PCR產(chǎn)物克隆連接到載體上，送上海生物工程有限公司(上海生工)進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行線上BLAST比對。發(fā)現(xiàn)該樣品HA片段基因與2022年以來，我國多發(fā)的H1亞型豬流感病毒分離株的同源性為98%～99%，同時NA的基因片段與我國近年來分離的多株N1亞型豬流感病毒的相同區(qū)域的基因同源性在98%～99%之間，表明該樣品為H1N1亞型豬流感病毒。

將測序得到的HA基因和NA基因分別用MEGA 6.06軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析[1]。參考序列為從GenBank中選取H1N1亞型豬流感病毒近年來國內(nèi)外主要流行株的HA、NA基因序列，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 H1亞型遺傳進(jìn)化樹

圖7 N1亞型進(jìn)化樹

2.5 分離病毒的理化特性測定

2.5.1 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗結(jié)果

按照熱穩(wěn)定性試驗的鑒定方法，將收集的病毒原液置于56℃水浴鍋中，分時間梯度對其進(jìn)行紅細(xì)胞凝集價的測定，結(jié)果見表4。該分離株病毒在56℃處理5 min后其紅細(xì)胞凝集價均下降2個滴度，符合血凝素?zé)岵环€(wěn)定型的標(biāo)準(zhǔn)，可判定該分離株屬于血凝素?zé)岵环€(wěn)定型病毒。

表4 病毒耐熱性試驗結(jié)果

2.5.2 耐熱性試驗結(jié)果

對病毒尿囊液進(jìn)行56℃處理30 min、65℃處理5 min，或100℃處理1 min，接種雞胚后測定，無法檢測到血凝性[2]，結(jié)果見表5。表明該毒株對熱敏感。

表5 病毒對乙醚、氯仿和耐酸性試驗測定結(jié)果 [3-5]

2.5.3 對乙醚敏感的試驗結(jié)果

將收獲的病毒尿囊液用乙醚處理后接種雞胚后EID50下降2個滴度以上，結(jié)果見表5。表明分離株對乙醚敏感。

2.5.4 氯仿敏感試驗結(jié)果

將病毒尿囊液經(jīng)氯仿處理后接種雞胚后EID50下降2個滴度以上，結(jié)果見表5。表明分離株對氯仿敏感。

2.5.5 耐酸性試驗結(jié)果

將病毒尿囊液分別經(jīng)pH值為3.0和pH值為10.0的條件下，處理后接種到雞胚，EID50下降2個滴度以上，結(jié)果見表5。表明分離株對酸堿敏感。

3 動物回歸試驗

將滿足病毒含量測定要求的分離純化病毒液用于4周齡健康易感豬進(jìn)行攻毒試驗。綜合分析攻毒后感染豬的臨床表征、心臟病變和病毒分離結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒組有80%的豬發(fā)病，對照組未見豬發(fā)病，表明分離株對豬具有較強的致病力，結(jié)果見表7、表8和圖8、圖9。由圖8、圖9可知，在攻毒豬肺臟的右尖葉、右心葉、左橫隔葉、右橫隔葉有斑點狀或斑塊樣肉樣實變；病理切片表明，攻毒組肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞增生，炎癥性細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔狹窄或閉塞。

表6 分離株病毒回歸豬試驗測定結(jié)果

表7 分離株病毒回歸豬試驗各指標(biāo)測定結(jié)果

圖8 豬流感病毒攻毒后肺臟病理變化

圖9 正常豬肺臟對照組

4 結(jié)果與討論

采集黑龍江綏化地區(qū)某豬場發(fā)病豬的鼻拭子樣本和肺臟組織樣本，通過感染雞胚的方法，成功分離到1株豬流感病毒。并對分離得到的病毒進(jìn)行了驗證和鑒定，通過動物的回歸試驗發(fā)現(xiàn)，分離出的豬流感名都對豬沒有致死性，但對豬的致病率可達(dá)100%，符合豬流感的一般特性。此外，分離得到的豬流感病毒毒株的全基因組序列、各節(jié)段基因的來源及對人有無感染性，還有待于進(jìn)一步研究。