奧日瀚，格日勒?qǐng)D

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院眼科）

胰島素自身免疫綜合征又稱自身免疫性低血糖，是由于血中非外源性胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度免疫活性胰島素和高效價(jià)胰島素自身抗體引起的，以反復(fù)發(fā)作性、嚴(yán)重自發(fā)性低血糖為特征的一種罕見病[1，2]。胰島素自身免疫綜合征在1970年由日本Hirata首次報(bào)道，故又稱Hirata病，在日本被列為自發(fā)性低血糖癥的第三大原因，需要與胰島素瘤和胰腺外腫瘤相互區(qū)分[3]。目前胰島素自身免疫綜合征的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是被廣泛認(rèn)可的原因是與自身免疫缺陷和含巰基藥物的作用相關(guān)，產(chǎn)生胰島素自身抗體導(dǎo)致高胰島素血癥，引發(fā)低血糖[4，5]。

糖基化修飾是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型之一，影響著如細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多種細(xì)胞功能[6，7]。研究表明蛋白質(zhì)主要有N型和O型兩種糖基化修飾類型，而GALNT2是調(diào)控黏蛋白O型糖基化起始步驟的重要酶[8，9]。有研究發(fā)現(xiàn)GALNT2的表達(dá)與酪氨酸激酶受體的活化有關(guān)，而EGFR是最早報(bào)道也是研究最多的酪氨酸激酶的受體，可以通過下游的PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)[10，11]。在肝癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞中，GALNT2可以通過糖基化修飾EGFR，進(jìn)而促進(jìn)EGFR的磷酸化，激活其下游信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的惡性程度[12]。

GALNT2和EGFR在多種腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮的功能已經(jīng)被多次報(bào)道，然而在代謝疾病發(fā)生發(fā)展中所起的作用，以及對(duì)該作用的分子機(jī)制卻仍需要探索。本研究表明GALNT2通過影響EGFR的翻譯后修飾，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)PPAR-γ和PEPCK的表達(dá)，提高了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和代謝。胰島素自身免疫綜合征患者在發(fā)病時(shí)會(huì)呈現(xiàn)血糖高低交替現(xiàn)象，并且出現(xiàn)嚴(yán)重的糖尿病酮癥酸中毒和低血糖[13]。我們的結(jié)果證實(shí)GALNT2通過EGFR及其下游信號(hào)通路，參與了細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝過程，引起體內(nèi)血糖和胰島素水平的變化，GALNT2的異常表達(dá)可能是胰島素自身免疫綜合征發(fā)病的原因之一。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃恒溫、CO2濃度為5%及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為了防止細(xì)菌污染，培養(yǎng)基可添加青/鏈霉素抗生素，其中青霉素的終濃度為100 U/mL，鏈霉素的終濃度為100μg/mL。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。提前24 h接種待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，細(xì)胞密度以第二天轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度達(dá)到50%~70%為宜。將過表達(dá)質(zhì)?；蛘遱iRNA與轉(zhuǎn)染試劑加入到不含血清的DMEM培養(yǎng)基中吹打混勻，室溫孵育20 min，逐滴加入上述轉(zhuǎn)染混合液，輕輕混勻后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6~8 h更換新鮮培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 蛋白免疫印跡（Western blot）

收集處理后的各組細(xì)胞，用RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，然后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。取20~60μg蛋白樣品，用SDSPAGE進(jìn)行分離，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%BSA室溫封閉1~2 h，分別加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 凝集素下拉試驗(yàn)

將細(xì)胞裂解液與長(zhǎng)柔毛野豌豆外源凝集素瓊脂糖珠在4℃共同孵育12 h，通過離心收集凝集素/糖蛋白復(fù)合物。將凝集素/糖蛋白煮沸變性分離，用Western blot檢測(cè)發(fā)生O型糖基化的EGFR蛋白含量，以細(xì)胞內(nèi)總EGFR蛋白含量作為對(duì)照。

1.4 葡萄糖、乳酸和NADP+/NADPH含量檢測(cè)

將待檢測(cè)細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集上清液用葡萄糖分析試劑盒和乳酸分析試劑盒測(cè)定葡萄糖和乳酸的含量，通過從培養(yǎng)基初始濃度中減去最終濃度來(lái)計(jì)算葡萄糖消耗量。使用NADP+/NADPH分析試劑盒在450 nm的光密度下測(cè)定細(xì)胞裂解物中的NADP+/NADPH比率。

1.5 RNA提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

使用Trizol試劑提取總RNA，取1μg總RNA按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。對(duì)合成的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，取2μL cDNA作為模板，加入特異基因引物，50μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)孔均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以β-actin作為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞葡萄糖攝取能力檢測(cè)

將待檢測(cè)細(xì)胞接種至96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)，用不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次后，加入不含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)15 min。加入用不含葡萄糖的培養(yǎng)基稀釋的探針，37℃下培養(yǎng)15 min，洗去多余的探針后在熒光顯微鏡下觀察葡萄糖攝取情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為兩組樣本均值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GALNT2對(duì)EGF刺激下EGFR磷酸化的影響

將轉(zhuǎn)染GALNT2過表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染siRNA的L-02細(xì)胞無(wú)血清處理6 h，隨后加入100 ng/mL的EGF刺激10 min，隨后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。結(jié)果表明過表達(dá)GALNT2增強(qiáng)了EGF誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平，而敲低GALNT2的細(xì)胞EGFR磷酸化水平明顯降低（見圖1）。

圖1 GALNT2對(duì)EGF刺激下EGFR磷酸化的影響

2.2 GALNT2對(duì)EGFR的O型糖基化水平的影響

為了探究GALNT2是否影響EGFR在L-02細(xì)胞中的O型糖基化水平，我們進(jìn)行了凝集素下拉試驗(yàn)。如圖2所示，過表達(dá)GALNT2增加了EGFR的O型糖基化，而敲低GALNT2的細(xì)胞EGFR的O型糖基化水平降低。

圖2 GALNT2對(duì)EGFR的O型糖基化水平的影響

2.3 GALNT2對(duì)EGFR下游PI3K/AKT通路活性的影響

前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在L-02細(xì)胞中GALNT2能夠促進(jìn)EGFR的磷酸化，隨后我們檢測(cè)了EGFR的下游信號(hào)通路。結(jié)果表明，過表達(dá)GALNT2能夠促進(jìn)AKT和mTOR的磷酸化，激活PI3K/AKT通路。而同時(shí)加入PI3K抑制劑LY294002則逆轉(zhuǎn)了GALNT2的作用，表明GALNT2確實(shí)是通過PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮功能（見圖3）。

圖3 GALNT2對(duì)EGFR下游PI3K/AKT通路活性的影響

2.4 GALNT2對(duì)細(xì)胞代謝能力的影響

過表達(dá)GALNT2的細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗增加（t=5.856，P＜0.05），乳酸生成增加（t=5.543，P＜0.05），并且細(xì)胞內(nèi)的NADPH/NADP+比例升高（t=4.364，P＜0.05），而同時(shí)加入PI3K抑制劑LY294002則逆轉(zhuǎn)了GALNT2的作用，表明GALNT2能夠通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞代謝（見表1）。

表1 GALNT2對(duì)細(xì)胞代謝能力的影響

2.5 GALNT2對(duì)PPAR-γ和PEPCK表達(dá)的影響

隨后我們檢測(cè)了糖代謝通路下游基因PPAR-γ和PEPCK的mRNA水平，結(jié)果表明過表達(dá)GALNT2的細(xì)胞中PPAR-γ和PEPCK的mRNA含量升高（**P＜0.05）（見圖4）。

圖4 GALNT2對(duì)PPAR-γ和PEPCK表達(dá)的影響

2.6 GALNT2對(duì)胰島素抵抗模型的細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響

最后我們用含有1μmol/L胰島素的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞16 h，構(gòu)建胰島素抵抗模型，通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)表明GALNT2增強(qiáng)了胰島素抵抗模型的細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取能力（見圖5）。

圖5 GALNT2對(duì)胰島素抵抗模型的細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響

3 討論

胰島素自身免疫綜合征是一種比較罕見的疾病，可以引發(fā)低血糖甚至死亡，在國(guó)內(nèi)外也都有誤診為胰島細(xì)胞瘤而進(jìn)行手術(shù)的病例報(bào)告[14]。這提醒我們正確全面地認(rèn)識(shí)這一疾病，探究其發(fā)病因素顯得尤為重要。我們的研究結(jié)果表明，GALNT2通過影響EGFR及其下游信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝過程，是導(dǎo)致機(jī)體血糖降低的原因之一，也初步揭示了胰島素自身免疫綜合征的發(fā)病的可能機(jī)制。

胰島素自身免疫綜合征的治療主要以清除胰島素自身抗體、及時(shí)糾正并預(yù)防低血糖的發(fā)生為主。治療措施包括停用可能誘發(fā)自身免疫的藥物、調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、選用阿卡波糖，通過延緩葡萄糖的吸收和降低胰島素的分泌而發(fā)揮作用。對(duì)于低血糖反復(fù)發(fā)作且難以控制的患者，可以口服糖皮質(zhì)激素或進(jìn)一步使用免疫抑制劑，病情嚴(yán)重的患者甚至需要血漿置換。我們的研究表明，PI3K的抑制劑LY294002能夠逆轉(zhuǎn)GALNT2對(duì)葡萄糖代謝的影響，延緩細(xì)胞代謝速率，對(duì)于胰島素自身免疫綜合征患者可能會(huì)有積極的作用，在將來(lái)的研究中我們可以嘗試使用EGFR信號(hào)通路的抑制劑來(lái)治療胰島素自身免疫綜合征等細(xì)胞代謝疾病。

有研究報(bào)道，GALNT2基因多態(tài)性與血脂HDLC和TG水平密切相關(guān)[15，16]。在GALNT2基因的第一個(gè)內(nèi)含子中存在6個(gè)研究較多的突變位點(diǎn)，不同的突變位點(diǎn)具有不同的生物學(xué)特性，在未來(lái)的研究中會(huì)不斷發(fā)掘GALNT2基因多態(tài)性與包括胰島素自身免疫綜合征在內(nèi)的多種疾病發(fā)生的關(guān)系。對(duì)GALNT2的生理功能進(jìn)一步探索，將有助于設(shè)計(jì)針對(duì)GALNT2功能的藥物，從平衡細(xì)胞內(nèi)的O型糖基化水平的角度來(lái)治療各類疾病，拓寬包括抗惡性腫瘤與調(diào)節(jié)代謝疾病等方面藥物的開發(fā)視野，為全人類的健康事業(yè)作出更多的貢獻(xiàn)。