韓慧琴，徐 鵬，賀麗霞，尹貽珍

（張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000）

中藥配方顆粒是通過現(xiàn)代制藥技術(shù)，以中藥飲片為原料，經(jīng)提取、過濾、干燥、制粒等系列過程制備而成的顆粒劑，其有效成分、性味、歸經(jīng)、主治、功效和傳統(tǒng)中藥飲片完全一致，保持了傳統(tǒng)中藥飲片的全部特征，既能保證中醫(yī)傳統(tǒng)的“君、臣、佐、使”和辨證論治、靈活加減的特點(diǎn)，優(yōu)于中成藥，又免去了傳統(tǒng)煎煮的麻煩，同時(shí)還可靈活地以單味顆粒沖服，衛(wèi)生有效[1～4]。中藥配方顆粒在國內(nèi)的應(yīng)用時(shí)間還比較短，仍需大力推廣[5]。主要因?yàn)槲覀兤鸩奖容^晚，大量的基礎(chǔ)工作需要從頭開始。從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來看，目前檢驗(yàn)項(xiàng)目還不是很全面，特別是安全性方面還有待提高。玫瑰花為薔薇科植物玫瑰（Rosa rugosaThunb）的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效[6，7]，為常用藥材。玫瑰花配方顆粒目前無統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于特征圖譜的研究有一篇報(bào)道[8]，但其以沒食子酸為參照物。本實(shí)驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[9～11]以槲皮素為參照建立了指紋圖譜和槲皮素與山柰素的含量測(cè)定方法?？蔀槊倒寤ㄅ浞筋w粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT-PDA型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters e2695-2998-PDA型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；“藥典委中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）”；SPSS-19.0統(tǒng)計(jì)軟件；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯，精度：0.01 mg）；C9860A型超聲波清洗器（CBL Photoelectron technology）；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100081-201610）與山柰素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110861-202013）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇及磷酸為色譜純；水為超純水。15批飲片分別購自甘肅（3批）、廣東（3批）、福建（3批）、浙江（3批）和山東（3批）5個(gè)省區(qū)，自制標(biāo)準(zhǔn)湯劑，批號(hào)分別為TJ01-TJ15。收集玫瑰花配方顆粒2個(gè)廠家共3批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱均為C18（5μm，250 mm×4.6 mm I.D.），分 別 采 用YMC-Pack、Waters Symmetry、Agilent、Inertsil和BOS HYPERSIL5個(gè)生產(chǎn)廠家的色譜柱。流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）（見表1）。

表1 檢測(cè)條件

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑及溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取15批次玫瑰花藥材各200 g，分別加水2400 mL，浸泡30 min，煎煮20 min，過濾，取濾渣加水2000 mL，煎煮15 min，用100目篩過濾，合并濾液，于50℃減壓濃縮，低溫干燥，得干浸膏，15批次平均出膏96.4 g，平均出膏率為48.2%。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取槲皮素12.44 mg與山柰素10.67 mg，加甲醇制成每1 mL含槲皮素248.8μg、山柰素213.4μg的混合溶液。

2.2.3 供試品溶液 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑或供試品，研細(xì)（過四號(hào)篩），取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min放冷過濾，分別精密量取濾液5 mL、加入70%甲醇5 mL、25%鹽酸溶液5 mL，加熱回流1 h放冷，定容至25 mL量瓶中搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL注入液相色譜儀，結(jié)果槲皮素、山柰素與其他組分的分離度均＞1.5，且峰型好（見圖1）。

圖1 HPLC色譜圖 （A）槲皮素 （B）槲皮素和山柰素混合對(duì)照品 （C）標(biāo)準(zhǔn)湯劑 （D）市售樣品3.槲皮素峰；5.山柰素峰

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用移液槍分別精密量取2、5、10、50、100μL，分別加甲醇定容至1.0 mL，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取20μL注入液相色譜儀，以濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、以峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素與山柰素的回歸方程分別為A=75273 C-95427（r=0.9999），A=72283C-24833（r=0.9999），槲皮素與山柰素的線性范圍分別為0.4976～24.88μg·mL-1和0.4268～21.34μg·mL-1。

2.3.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑（批號(hào)：TJ01）9份，每份約0.6 g，分別加入一定量的槲皮素與山柰素對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液。按上述檢測(cè)方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，各指標(biāo)成分回收率RSD值均＜3.0%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2、表3。

表2 槲皮素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下的同一供試品溶液（批號(hào)：TJ01），連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定。槲皮素與山柰素峰面積的RSD分別為0.5%和0.4%，均＜2.0%。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑（批號(hào)：TJ01），照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果槲皮素和山柰素含量的RSD分別為0.2%和0.3%，均＜2.0%。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：TJ01），分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣9次，結(jié)果槲皮素含有量的RSD為0.6%，山柰素含量的RSD為0.2%，均＜2.0%。

2.3.7 耐用性實(shí)驗(yàn) 采用2個(gè)廠家的高效液相色譜儀、5個(gè)廠家的色譜柱按擬定的方法測(cè)定，結(jié)果槲皮素含有量的RSD為1.2%，山柰素含量的RSD為1.4%，均＜2.0%。

2.3.8 樣品的測(cè)定 取15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑及2個(gè)廠家的玫瑰花配方顆粒3批，按前述“2.2.3”項(xiàng)下的方法操作，制成供試品溶液，按上述檢測(cè)方法測(cè)定，計(jì)算樣品的含量，結(jié)果見表4。15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑槲皮素含量為4.76~6.84 mg·g-1，山柰素含量為1.56~2.13 mg·g-1。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

分別精密吸取不同批次（TJ01-TJ15）的玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液、玫瑰花配方顆粒3批樣品供試品溶液、槲皮素與山柰素的混合對(duì)照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖（見圖1）。將15批樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“藥典委中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.130723版本），采用中位數(shù)法對(duì)不同樣品的指紋圖譜進(jìn)行峰點(diǎn)校正，數(shù)據(jù)匹配分析，生成對(duì)照指紋圖譜（見圖2、圖3），指定5個(gè)共有峰為特征峰，并用對(duì)照品圖譜進(jìn)行定位，確定3號(hào)峰為槲皮素，5號(hào)峰為山柰素。以3號(hào)峰（槲皮素）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（結(jié)果見表5、表6）。15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.978、0.993、0.997、0.995、0.996、0.992、0.993、0.997、0.996、0.979、0.987、0.997、0.993、0.978、0.997。相似度評(píng)價(jià)表明，15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜和對(duì)照品指紋圖譜的相似度良好；3批玫瑰花配方顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.993、0.997和0.987。

圖2 15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜

圖3 15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋疊加圖譜

表5 15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表6 15批玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對(duì)峰面積

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考查

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：TJ01），連續(xù)測(cè)定6次，以3號(hào)峰（槲皮素）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果5個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD與相對(duì)峰面積RSD均＜2.0%。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 照“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份進(jìn)行分析。結(jié)果5個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD與相對(duì)峰面積RSD均＜2.0%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：TJ01），照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣9次，以3號(hào)槲皮素峰為參照峰，計(jì)算5個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果均＜2.0%。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過程中考察了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇4種提取溶劑的提取效率，比較了酸水解前后各成分的含量差異；考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，考察了高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀的檢測(cè)效果，最終確定了文中的方法，該條件下色譜峰信息豐富、分離度好、穩(wěn)定性高，可以作為控制玫瑰花配方顆粒的方法。

3.2 對(duì)比相似度較小樣品與其他樣品的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)其共有峰相對(duì)保留時(shí)間比較一致，主要差異表現(xiàn)在色譜峰的面積上，即含量的差異。這表明不同產(chǎn)地樣品的質(zhì)量有一定差異，同一產(chǎn)地樣品質(zhì)量無明顯差異。

3.3 采用建立的含量測(cè)定方法和指紋圖譜方法對(duì)市售2個(gè)廠家3批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，含量測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致，指紋圖譜的相似度也與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，說明市售樣品的質(zhì)量較好。

3.4 從含量測(cè)定結(jié)果可知，相同產(chǎn)地槲皮素和山柰素的含量基本一致，不同產(chǎn)地的含量略有差別，可能與氣候、土壤和生長環(huán)境有關(guān)。

3.5 本實(shí)驗(yàn)通過指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)對(duì)不同產(chǎn)地的玫瑰花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜進(jìn)行了定性、定量評(píng)價(jià)，并對(duì)市售樣品進(jìn)行測(cè)定，并評(píng)價(jià)其質(zhì)量。研究結(jié)果表明，本方法具有良好的專屬性和準(zhǔn)確性，可作為玫瑰花配方顆粒的定性定量分析方法。

3.6 用建立的方法對(duì)市售2個(gè)廠家3批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，不同廠家的樣品指紋圖譜比較一致，相似度都在0.98以上，但峰面積仍存在著差異，說明各廠家的生產(chǎn)工藝和藥材來源可能不盡相同。