田顯庭，董 馨，張秀艷，李春燕，陸景坤，薛培鳳＊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種全身性骨病，其特征是骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致骨脆性增加，容易骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥引起的骨折已成為老年人死亡和致殘的主要原因之一。隨著我國人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥已成為我國面臨的重大公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥與骨萎縮相似，根據(jù)中醫(yī)理論，“腎主骨”“脾主肌”“氣血不通則痛”[2]。

目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物以西藥為主，大部分為補(bǔ)鈣、維生素D、雙膦酸鹽類、激素類等，雖然這些藥物有固定的治療機(jī)制和靶點，具有顯著的療效，但是這些藥物副作用明顯，往往會對其他組織器官造成影響，因此亟待找到一種療效顯著同時副作用較小的藥物[2]。近年來蒙藥發(fā)展迅速，而其中二味杜仲湯就是一種蒙醫(yī)常用的治療骨科疾病的方劑，由杜仲和藍(lán)刺頭組成，具有壯骨、接骨療傷的功效[3]。此方使用多年，副作用較小，而且療效顯著，可以彌補(bǔ)西藥的不足。

此藥方又名塔布森-2，已有研究中多以體外質(zhì)量控制和藥效研究為主，臨床研究表明此方對骨質(zhì)疏松癥有顯著的療效，但是對于效應(yīng)成分卻尚未闡述。藥物經(jīng)過特定的傳輸途徑，入血、代謝、分布進(jìn)而產(chǎn)生療效，因此，入血成分有可能是最終的效應(yīng)成分，所以有必要研究血液中的成分，為進(jìn)一步明確此方的藥效成分和代謝途徑提供科學(xué)依據(jù)[4]。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

咖啡酸（批號：16081502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、綠原酸（批號：SH17101905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、異綠原酸C（批號：SH17120101，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥98%）、異綠原酸A（批號：SH17011305，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、原兒茶酸（批號：SH171208，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、龍膽酸（批號：SH17030706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、綠原酸B（批號：SH18030501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、阿魏酸（批號：SH17071213，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、表兒茶素（批號：16080706，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥98%）、隱綠原酸（批號：SH17103101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、新綠原酸（批號：SH17100904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、京尼平苷酸（批號：SH19011705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、黃芩苷（批號：SH180206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、紫云英苷（批號：SH17103002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、松脂醇二葡萄糖苷（批號：SH18052807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、桃葉珊瑚苷（批號：SH171110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、去乙酰車葉草苷酸（批號：SH180206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），以上標(biāo)品均購自北京賽百草有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲酸（色譜純，天津永晟精細(xì)化工有限公司）。

本研究所用的杜仲、藍(lán)刺頭藥材經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定，分別為杜仲科植物杜仲（Eucommiau1moidesOliv.）的干燥樹皮、菊科植物驢欺口（EchinopslatifoliusTausch）的干燥花序。

1.2 實驗儀器

本實驗所用到儀器及具體信息見表1。

表1 實驗儀器Tab.1 Experimental equipments

1.3 實驗動物

Wistar雄性大鼠（購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心，SPF級），體質(zhì)量（240±20）g，許可號：SCXK（內(nèi)蒙古）2016-01。動物在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心常規(guī)飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，保持（24±2）℃的室溫、（55±5）℃的相對濕度和12 h的暗光周期。實驗前禁食12 h，正常飲水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3 C18-PFP（3μm，100 mm×3 mm）；流動相中有機(jī)相（A）為0.2%甲酸甲醇，水相（B）為含0.2%甲酸-超純水，梯度洗脫程序為：0～0.8 min，2%～5%（A）；0.8～1.7 min，5%～10%（A）；1.7～2.5 min，10%～18%（A）；2.5～3.3 min，18%～23%（A）；3.3～4.2 min，23%～28%（A）；4.2～5.8 min，28%～33%（A）；5.8～9.2 min，33%～43%（A）；9.2～11.2 min，43%～46%（A）；11.2～14.3 min，46%～60%（A）；14.3～16 min，60%～65%（A）；16～17.7 min，65%～68%（A）；17.7～19.2 min，68%～75%（A）；19.2～20 min，75%～80%（A）；20～20.8 min，80%～2%（A）；20.8～24 min，2%（A），流速為0.3 mL/min，4℃自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5μL，柱溫30℃。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子檢測，全掃描（full-scan）模式下獲取質(zhì)譜信息。由于黃酮及酚酸類成分在負(fù)離子模式（ESI-）下離子化效果較好，且酚酸類成分在正離子模式下響應(yīng)較差，因此本文采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。質(zhì)譜條件如下：①鞘氣流速（Sheath gas flow rate）：35 L/min；②輔助氣流速（Aux gas flow rate）：10 L/min；③噴霧電壓（Spray voltage）：2.8 kV；④毛細(xì)管離子傳輸管溫度（Capillary temperature）：350℃；⑤S-lens電壓（S-lens RF level）：50 kV；⑥加熱溫度（Aux gas heater temperature）：150℃。

2.3 原型成分?jǐn)?shù)據(jù)處理

首先建立EDD化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，通過中國知網(wǎng)、PubMed、ETCM、TCMSP、SymMap等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫或平臺檢索TFES中各單味藥材中的化學(xué)成分，建立一個包含化合物名稱、化學(xué)式和分子量的數(shù)據(jù)庫。將負(fù)離子模式下檢測到的HPLC-（-）ESI-MS譜導(dǎo)入Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，得到質(zhì)荷比（m/z）、保留時間（Rt）等信息，通過高分辨質(zhì)譜計算出的精確分子量，結(jié)合已經(jīng)完善的數(shù)據(jù)庫信息和對照品的比對，篩選出體內(nèi)原型成分。質(zhì)譜偏差范圍δ ≤5×10-6。

2.4 體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)處理

將含藥血漿和空白血漿的原始譜圖導(dǎo)入到Compound discover3.0軟件，并將EDD的體外化合物列表以mol格式導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫中，保留時間誤差設(shè)為0.3 min，質(zhì)核比誤差為5 ppm，最多反應(yīng)步數(shù)為3。在體內(nèi)代謝模式下計算每個化合物的所有I相和II相代謝產(chǎn)物，推測各類化合物可能的代謝過程。

2.5 對照品溶液及灌胃藥液的制備

2.5.1 對照品溶液的制備 精確稱取各對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，使體積恒定。制備每種濃度為1 mg/mL的化合物儲備溶液。所有儲備溶液儲存在4℃的冰箱中，以備日后使用。

2.5.2 灌胃藥液的制備 精密稱取EDD藥材細(xì)粉50 g（杜仲、藍(lán)刺頭各25 g），置于1 L圓底燒瓶中，加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min，100℃，回流提取2次，每次30 min，用180目篩過濾，兩次藥液混合，濃縮后冷凍干燥，以獲得凍干粉供日后使用。使用時用適量蒸餾水溶解，使凍干粉含量為20 mg/mL（相當(dāng)于EDD生藥量83.3 mg/mL）。凍干粉置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 血漿樣品的制備

取雄性Wistar大鼠10只，其中空白組3只，給藥組7只?？瞻捉M給予5 mL蒸餾水，給藥組給予5 mL的藥物溶液（相當(dāng)于3.33 g/kg的EDD凍干粉）。給藥組大鼠給藥15、30、60、120、240、360 min后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）用于麻醉，從腹主動脈采血，置于肝素化采血管中，在3500r· min-1下離心10 min，取上層血漿并放置在-20℃下，保存在冰箱中以備日后使用。

2.7 血漿樣品的處理

取各時間點血漿200μL，加入3倍量（含0.15%甲酸）乙腈，旋渦并混合1 min，在4℃下以13000r· min-1離心血漿樣品10 min以沉淀蛋白質(zhì)，取上清液，并在室溫下用氮?dú)獯蹈缮锨逡?，將殘余物溶解?00μL 50%色譜甲醇中，旋渦1 min，在13000r· min-1和4℃下離心10 min，并取上清液供使用。

2.8 樣品前處理優(yōu)化

2.8.1 給藥劑量優(yōu)化 取2.5.2項下凍干粉適量，分別對大鼠進(jìn)行灌胃給藥（劑量分別為1.67 g/kg、3.33 g/kg、5.00 g/kg、6.67 g/kg）。所有大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。將采集的全血置于5 mL肝素化EP管中，3500r·min-1離心10 min，分離血漿。用乙腈沉淀蛋白法進(jìn)行處理，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。其中1.67 g/kg（臨床等效劑量的5倍）下檢測到的成分?jǐn)?shù)目較少，5.00 g/kg和6.67 g/kg（臨床等效劑量的15倍和20倍）無明顯差別，3.33 g/kg（臨床等效劑量的10倍）下檢測到的成分?jǐn)?shù)目最多，且基線最好，故選擇3.33 g/kg為最終給藥劑量（見圖1）。

圖1 不同給藥劑量的大鼠血漿總離子流圖Fig.1 Total ion current diagrams of rat plasma in different doses

2.8.2 采血時間的優(yōu)選對給藥后不同采血時間點的血樣進(jìn)行預(yù)處理，通過進(jìn)樣采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。綜合比較15、30、60、120、240、360 min的譜圖，可以發(fā)現(xiàn)240 min后譜圖中TFES的原型成分已基本消除，因此在給藥后15、30、60、120 min收集大鼠。分析用血樣，其中120 min時檢測到的成分最多且峰形好。

2.8.3 含藥血漿沉淀蛋白方法優(yōu)選為了使待測樣品測得的圖譜整體響應(yīng)值更好，峰數(shù)目更多，峰強(qiáng)度更高，實驗前期對血樣的處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。我們考察了不同蛋白沉淀劑對整體圖譜中待測成分的影響。采用乙腈、甲醇分別以不同比例（1∶2、1∶3、1∶4）作為沉淀劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈按照1∶3的比例作為沉淀劑時圖譜整體峰多，內(nèi)源性干擾較少，且多數(shù)入血成分富集程度較高，響應(yīng)值較好（見圖2）。

圖2 不同處理方式的大鼠血漿總離子流圖Fig.2 Total ion current diagrams of rat plasma with different treatments

2.8.4 色譜條件優(yōu)化 本實驗前期比較了流動相水相中甲酸的含量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，v/v）對入血成分分離度和靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相中不加甲酸，以綠原酸、咖啡酸為代表的酚酸成分嚴(yán)重拖尾，低濃度條件下難以基線分離。隨著甲酸濃度的增加，酚酸類成分拖尾現(xiàn)象顯著改善，但同時黃酮類成分呈現(xiàn)峰面積先增加后減小的趨勢，酚酸類成分峰面積明顯減小。最終確定以加入體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸超純水作為水相，方劑血漿圖譜整體性較好。

2.9 二味杜仲湯入血原型成分分析

通過建立EDD化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，共收集了組方藥材中的原型成分246個。通過全面分析含藥血漿、空白血漿、EDD方劑、杜仲藥材、藍(lán)刺頭藥材的質(zhì)譜圖，以高分辨質(zhì)譜計算的精確分子量搜索各圖譜準(zhǔn)分子離子峰，并通過保留時間比對確認(rèn)各圖譜的共有峰，同時結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息確認(rèn)藥材吸收入血的原型成分?？瞻籽獫{中出現(xiàn)共有色譜峰，視為體內(nèi)的內(nèi)源性成分，暫不做吸收入血成分分析。大鼠給藥2 h后的總離子流圖見圖3。

圖3 給藥2 h后大鼠血漿的總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of rat plasma two hours after administration

3 結(jié)果

通過全面分析含藥血漿、空白血漿、EDD方劑、杜仲藥材、藍(lán)刺頭藥材的質(zhì)譜圖，使用高分辨質(zhì)譜計算的精確分子量搜索各圖譜準(zhǔn)分子離子峰，并通過保留時間比對確認(rèn)各圖譜的共有峰，同時結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息確認(rèn)藥材吸收入血的原型成分。此外將含藥血漿和空白血漿原始圖譜導(dǎo)入Compound discover 3.0軟件，并將EDD的體外化合物以mol格式導(dǎo)入軟件，計算體內(nèi)代謝模式下各化合物的所有Ⅰ、Ⅱ相代謝產(chǎn)物，獲得化合物的保留時間、質(zhì)量核比、反應(yīng)類型、匹配度等信息，結(jié)合軟件分析結(jié)果和參考文獻(xiàn)推測可能的代謝物。共鑒定出43個入血移行成分，其中有29個原型成分，14個代謝成分。結(jié)果見表2、表3。

表2 EDD血漿中原型成分的鑒定Tab.2 Identification of prototype components in EDD plasma

表3 EDD代謝產(chǎn)物鑒定Tab.3 Identification of EDD metabolites

3.1 黃酮類化合物代謝產(chǎn)物

M1保留時間17.973 min，分子式C17H18O7，誤差0.531，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為333.10525，比貫眾苷準(zhǔn)分子離子峰315.08631多18 Da（H2O）。根據(jù)軟件分析為貫眾苷的水合反應(yīng)，因此，化合物初步判斷為貫眾苷的水合產(chǎn)物。

M2保留時間19.52 min，分子式為C19H22O6，誤差0.955，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為345.14164，比貫眾苷準(zhǔn)分子離子峰315.08631多30 Da（C2H6）。根據(jù)軟件分析，可能存在還原反應(yīng)、水合反應(yīng)、乙?；磻?yīng)，最終生成此化合物。

M3保留時間10.7 min，分子式為C18H16O5，誤差0.76，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為311.09977，比貫眾苷準(zhǔn)分子離子峰315.08631少4 Da（+C-O）。根據(jù)軟件分析，可能存在甲基化反應(yīng)，脫水反應(yīng)最終生成此化合物。代謝規(guī)律推導(dǎo)圖見圖4。

圖4 貫眾苷在大鼠體內(nèi)代謝規(guī)律圖Fig.4 Metabolism of guanzhong glycoside in rats

3.2 苯丙素類化合物代謝產(chǎn)物

M6保留時間12.22 min，分子式為C9H8O3，誤差0.819，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為163.04734，比咖啡酸準(zhǔn)分子離子峰179.04226少16 Da（-O）。根據(jù)軟件分析，可能存在脫水反應(yīng)和還原反應(yīng)，最終生成此化合物。

M7保留時間11.14 min，分子式為C11H11NO3，誤差1.39，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為204.07389，比咖啡酸準(zhǔn)分子離子峰179.04226多25 Da（-O+C2H3N）。根據(jù)軟件分析結(jié)果，可能存在硝基還原反應(yīng)，甘氨酸結(jié)合反應(yīng)，最終生成此化合物。

M8保留時間9.73 min，分子式為C9H10O3，誤差為0.529，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為165.06299，比咖啡酸準(zhǔn)分子離子峰179.04226少14 Da（-O+2H）。根據(jù)軟件分析結(jié)果，可能存在還原反應(yīng)，羥基化反應(yīng)，最終生成此化合物。

M9保留時間7.17 min，分子式為C14H12N2O4，誤差為0.047，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為271.07971，比咖啡酸準(zhǔn)分子離子峰179.04226多92 Da（+C5H4N2）。根據(jù)軟件分析結(jié)果，可能存在脫水反應(yīng)，谷氨酰胺結(jié)合反應(yīng)，最終生成此化合物。代謝規(guī)律推導(dǎo)圖（見圖5）。

圖5 咖啡酸在大鼠體內(nèi)代謝規(guī)律圖Fig.5 Metabolism of caffeic acid in rats

4 討論

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，而且含量較低，因此進(jìn)入體內(nèi)的就更少，代謝產(chǎn)物就少之又少。Q-Exacive MS/MS技術(shù)不僅可以提供母離子及多級碎片子離子的精確分子量，且掃描速度快、靈敏度高，是作為體內(nèi)成分鑒定的理想工具。軟件Compound discover可以輔助鑒定血中原型成分的所有Ⅰ相和Ⅱ相代謝產(chǎn)物[14]。兩者結(jié)合可以較全面地分析入血成分。生物樣本內(nèi)源性成分對入血成分的檢測有很大的影響，因此需要對生物樣品進(jìn)行前處理，減少內(nèi)源性成分的干擾[15～16]。藥物在體內(nèi)的代謝主要存在于肝組織中，代謝反應(yīng)主要包括Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝。Ⅰ相代謝是機(jī)體經(jīng)歷氧化、還原和水解反應(yīng)，并將-OH、-COOH、-NH2、-SH和其他極性基團(tuán)引入母體藥物。II相代謝是指藥物分子的極性基團(tuán)和體內(nèi)具有更大水溶性的內(nèi)源性化合物如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等共價結(jié)合后，形成水溶性高、極性好的代謝物[17～18]。

從EDD的入血成分可以發(fā)現(xiàn)，吸收的成分主要集中在黃酮類和苯丙素類，另外還有個別環(huán)烯醚萜、倍半萜類等化合物，而且入血的母核也是苯丙素和黃酮類比較多。通過代謝規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，黃酮類主要的代謝反應(yīng)有還原、水合、乙?；⒓谆菼相代謝反應(yīng)，有個別反應(yīng)涉及到葡萄糖結(jié)合，氨基酸結(jié)合反應(yīng)等II相反應(yīng)。而苯丙素類化合物主要涉及脫水、羥基化、還原、硝基還原、氨基酸結(jié)合等II相代謝反應(yīng)?？傊?，部分入血成分通過體內(nèi)代謝反應(yīng)增加其極性，便于經(jīng)過尿液和膽汁排泄，EDD中大部分成分以原型成分進(jìn)行吸收代謝。但是這些成分是否可以作為此方的藥效成分、是否具有這樣的代謝途徑，還需要進(jìn)一步通過藥效實驗、代謝組學(xué)等相關(guān)方法進(jìn)行驗證。