郭 琦， 王向斌， 黃 茜， 梁子怡， 王心雨， 劉慧芬＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 河南新鄉(xiāng) 453007）

抗繆勒氏管激素（Anti-Müllerian hormone，Amh）又稱繆勒氏管抑制物， 是轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β） 超家族中的一員[1]。在哺乳動物中，Amh表達于精巢的支持細胞，可引起繆勒氏管的退化，維持雄性特征[2]。 雌性個體中，Amh在原始卵泡的募集以及優(yōu)勢卵泡選擇中發(fā)揮重要作用[3]。 雖然絕大多數(shù)魚類沒有繆勒氏管，但是卻保留了Amh基因。 2002年在日本鰻鱺中發(fā)現(xiàn)Amh基因，主要在支持細胞中表達，與精子發(fā)生有關(guān)[4]。 硬骨魚類中，雖然Amh主要在雄性性別分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其在雌性卵巢中也有表達。 在斑馬魚中敲除Amh基因會導(dǎo)致卵巢肥大，初級卵母細胞數(shù)量顯著增多，卵母細胞發(fā)育進程受阻[5]。 使用花鰭骨AMH重組蛋白對卵母細胞進行體外孵育， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMH重組蛋白可以促進花鰭骨卵母細胞成熟[6]。這說明Amh在魚類性腺發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，隸屬于鱸形目 （Perciformes）、 太陽魚科（Cehtrachidae）、黑鱸屬（Micropterus），具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強、 生長迅速、 適溫范圍較廣等優(yōu)點。 大口黑鱸自1983年被引入內(nèi)地以來， 在全國多地區(qū)實現(xiàn)了人工養(yǎng)殖[7]。目前關(guān)于大口黑鱸品種開發(fā)、營養(yǎng)品質(zhì)、養(yǎng)殖模式分析等方面已有較多研究， 但是有關(guān)其性腺發(fā)育及相關(guān)分子調(diào)控機制的研究鮮有報道。

本研究利用已經(jīng)獲得的大口黑鱸Amh基因cDNA全長序列，構(gòu)建原核表達載體，制備多克隆抗體，以期為研究Amh基因的功能及其在大口黑鱸性腺發(fā)育中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

大口黑鱸購自于新鄉(xiāng)市洪門鎮(zhèn)鱸魚養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。 用于多克隆抗體制備的小鼠購自華蘭生物工程股份有限公司。

感受態(tài)細胞、限制性內(nèi)切酶、pET-32a（+）載體等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。 彩虹180廣譜蛋白Marker、 弗氏佐劑等購自北京索萊寶科技有限公司。His Tag HP鎳柱購自上海生工生物工程股份有限公司。 實驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)Amh基因序列， 選擇合適的區(qū)域設(shè)計特異性引物， 同時根據(jù)原核表達載體pET32a的圖譜選取酶切位點，具體信息見表1：

表1 重組載體引物

以大口黑鱸卵巢cDNA為模板，通過PCR擴增序列、 瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。 將回收產(chǎn)物和pET-32a質(zhì)粒用BamH I 和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切（37℃，過夜），酶切產(chǎn)物純化后，構(gòu)建重組表達載體pET32a-AMH。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序， 采用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行比對分析，以判斷目的基因是否正確插入載體。

1.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達

將陽性表達菌接入LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)（取部分菌液作為對照），37℃震蕩培養(yǎng)至OD6000.5左右， 向其中加入IPTG （Isopropyl β-D- Thiogalactopyranoside，終濃度1 mmol/L）進行誘導(dǎo)表達，37℃震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)6 h、8 h、10 h及12 h后取材，12000 rpm離心20 min，收集沉淀。菌體沉淀以4×loading buffer重懸裂解，隨后使用SDS-PAGE對總菌體、沉淀和上清進行檢測。

1.4 融合蛋白純化及抗體制備

用上述條件大量誘導(dǎo)蛋白， 在室溫下8000 rpm離心5 min收集菌體， 加入適量變性結(jié)合緩沖液，超聲波破碎 （破3 s， 停3 s， 功率50%， 破碎總時間30 min），獲得融合蛋白，用His Tag HP柱純化蛋白。蛋白純化所需試劑配制及操作方法參照馮軍廠的方法[8]。 用純化透析后的融合蛋白免疫小鼠，每隔一周加強免疫一次， 首次將融合蛋白與弗氏完全佐劑等比混合后對小鼠進行皮下注射， 之后每次將融合蛋白與弗氏不完全佐劑等比混合后注射，4周后采血獲得抗血清。

1.5 抗體效價檢測

利用酶聯(lián)免疫 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測制備抗體的效價，測定時以未免疫的小鼠血清作為陰性對照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析， 不同組之間的差異顯著性（P＜0.05）采用單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，Duncan氏方法多重比較， 實驗數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體構(gòu)建

以大口黑鱸卵巢cDNA為模板進行擴增，獲得的目的片段與預(yù)期大小一致 （圖1 a）。 重組質(zhì)粒pET32a-AMH經(jīng)單雙酶切驗證， 檢測目的片段已成功導(dǎo)入表達載體（圖1 b）。 隨后，將產(chǎn)物進行純化、測序，結(jié)果表明構(gòu)建的pET32a-AMH正確。

圖1 Amh目的片段擴增及驗證

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達及可溶性檢測

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-AMH轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。 隨后采用IPTG在16℃下進行誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，在52.3 kDa左右出現(xiàn)目的條帶，而對照在同一區(qū)域未出現(xiàn)特異條帶， 表明重組表達載體pET32a-AMH構(gòu)建成功。 誘導(dǎo)后菌體經(jīng)超聲破碎、離心、SDSPAGE電泳分析表明重組蛋白主要存在于沉淀中。

2.3 重組蛋白純化

對誘導(dǎo)菌液進行收集、破碎，利用親和純化的方法，對AMH融合蛋白進行純化。使用不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白，SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果顯示，100 mM咪唑洗脫時開始檢測到目的蛋白；150 mM和200 mM咪唑洗脫時，檢測到大量的目的蛋白，但是200 mM 咪唑濃度洗脫時，獲得的目的蛋白純度更高（圖2）。經(jīng)透析去除雜質(zhì)，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，純化后的雜蛋白明顯減少，條帶較為單一，可用于后續(xù)實驗（圖3）。

圖3 AMH重組蛋白不同濃度咪唑洗脫結(jié)果

圖4 AMH重組蛋白純化

2.4 AMH多克隆抗體制備及效價檢測

經(jīng)過4次免疫，獲得鼠源AMH抗血清。 使用酶聯(lián)免疫吸附方法對獲得的多克隆抗體血清進行效價測定，結(jié)果顯示多克隆抗體的效價為2.7×105，可為后續(xù)實驗提供原材料。

3 討論

抗繆勒氏管激素是轉(zhuǎn)化生長因子家族成員之一，在哺乳動物中具有調(diào)節(jié)細胞發(fā)育及分化，誘導(dǎo)繆勒氏管退化，維持雄性特征的作用。當(dāng)前已有較多研究表明，Amh在哺乳動物卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。 在硬骨魚類中，Amh多被當(dāng)作雄性性別分化關(guān)鍵基因。 尼羅羅非魚XX個體中，amhy的過表達導(dǎo)致了雌性到雄性的性逆轉(zhuǎn)[9]。 也有研究表明，Amh在雌性個體卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。 在黑鯛研究中發(fā)現(xiàn)，Amh在卵巢發(fā)育早期不表達，在卵黃蛋白原合成期表達量升高[10]。 斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)，Amh缺失會導(dǎo)致雌魚性腺發(fā)育不良，卵泡發(fā)生受阻[11]。 這說明，Amh基因在魚類性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

原核表達是外源基因融合表達的方式之一， 具有易培養(yǎng)、生長快、操作簡單等優(yōu)點[12]。 多克隆抗體具有穩(wěn)定性較好、制備技術(shù)要求不高、周期短、成本低等優(yōu)點，廣泛用于蛋白亞細胞定位、蛋白互作、細胞信號通路等研究領(lǐng)域[13]。 本研究利用獲得的大口黑鱸Amh基因序列，成功構(gòu)建pET32a-AMH原核表達載體，誘導(dǎo)出大小為52.3kDa的AMH重組蛋白， 與奧利亞羅非魚49kDa的AMH重組蛋白[14]及雙須骨舌魚48kDa的AMH重組蛋白[15]大小相近。隨后通過免疫小鼠，獲得AMH多克隆抗體，利用ELISA對抗體血清進行效價檢測，結(jié)果顯示多克隆抗體的效價為2.7×105，可用于后續(xù)研究。

本研究通過構(gòu)建大口黑鱸AMH原核表達載體，獲得AMH重組蛋白，利用重組蛋白對小鼠進行免疫，獲得AMH多克隆抗體。 獲得的大口黑鱸AMH重組蛋白和多克隆抗體可為后續(xù)研究Amh在大口黑鱸中的功能和作用機制提供基礎(chǔ)。