彭永彬，杜晨陽，鄭崇珂，周晉軍，孫偉，和亞男，謝先芝

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東 泰安 271018)

抽穗期反映了水稻品種對種植區(qū)域氣候和生態(tài)環(huán)境的適應性，是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一[1]。抽穗過早會導致水稻因?qū)狻豳Y源利用不足而減產(chǎn)，而抽穗過晚易遭遇低溫等災害天氣，同樣會導致減產(chǎn)[2]。水稻抽穗期受多種外界因素如光周期、溫度、土壤肥力等的影響，其中光周期是核心因素。水稻屬于短日照作物，短日照條件下促進開花，長日照條件下抑制開花[3]?；谒緦庵芷诘拿舾行裕渖L階段可分為基本營養(yǎng)階段(BVP)和光周期敏感階段[4]，其中，BVP的長短和對光周期的敏感性是由遺傳因素決定的，不同栽培品種由于具有不同的抽穗期基因型組合而表現(xiàn)出不盡相同的抽穗期，因此，研究水稻抽穗期及其相關基因，鑒定可適應不同地區(qū)的最佳抽穗期基因組合對培育地區(qū)適應性較強的品種具有重要意義。挖掘水稻抽穗期遺傳位點，通過分子育種將抽穗期位點導入性狀優(yōu)良但熟期不適的品種中，或是培育優(yōu)良水稻品種的關鍵。

水稻的抽穗期受多基因組成的復雜數(shù)量性狀基因座(QTLs)所調(diào)控。利用正、反向遺傳學和群體遺傳學，大量與抽穗期有關的基因被克隆，其中，有多個涉及水稻抽穗期感光性的主效基因，如Hd1、Hd6、Ghd7及DTH8等[5－11]?？寺〉某樗牖蚨鄶?shù)作用于成花基因的上游，可大致歸為兩種相互串聯(lián)的調(diào)控通路:OsGI－Hd1－Hd3a通路和以Ehd1為核心的調(diào)控通路。Hd1作為栽培稻馴化過程中受選擇的基因之一，其功能具有雙重性:在長日照條件下，Hd1促進Ghd7表達，并與之形成抑制復合體，抑制Ehd1－Hd3a開花通路，導致不同程度的延遲抽穗甚至不抽穗；而在短日照條件下，Ghd7表達下調(diào)，Hd1與抑制復合體形成競爭關系，促進Hd3a的表達，從而促進水稻抽穗[2，12]。Hd6是一個主效光周期響應位點基因[8]，編碼酪蛋白激酶CK2的α亞基，可通過磷酸化DTH7蛋白間接調(diào)控Hd1的表達，從而在長日照條件下抑制抽穗；此外，Hd6可磷酸化晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子OsLHY[13]，其不同自然變異類型能精調(diào)水稻抽穗期的晝夜臨界時長[14]。但Hd6延遲抽穗的作用僅僅是在其有功能的前提下才能發(fā)揮，‘日本晴’和‘Kasalath’的Hd6等位基因(Hd6Nip和Hd6Kasa)在編碼區(qū)存在一個核苷酸的替換，致使Hd6Nip編碼提前終止，而Hd6Kasa正常行使調(diào)控抽穗的功能[8，13]。Hd6基因的功能多樣性有助于水稻栽培面積進一步向北擴大，在水稻育種中具有重要的應用價值。分子標記是指以核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，能夠直接反映個體基因組DNA的差異。經(jīng)典的分子標記主要有RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)、SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)、SNP(single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)以 及InDel(insert and deletion，插 入 缺失)[15－17]等。利用分子標記育種技術，可實現(xiàn)對水稻產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等方面的改良[18]。PARMS技術是基于擴增受阻突變的體系PCR(ARMS－PCR)開發(fā)的一種SNP基因分型技術[19]，增加了兩條不同熒光標記引物，可通過熒光信號的差異檢測基因的多態(tài)性。與傳統(tǒng)的需要電泳分型的標記相比，PARMS標記具有操作簡便、耗時短、成本低等優(yōu)點，而且可基于CRISPR/Cas9基因編輯過程中產(chǎn)生的單堿基插入缺失和小片段缺失對基因編輯后代進行基因分型鑒定。

本研究根據(jù)水稻抽穗期基因Hd6Kasa的SNP位點開發(fā)了一個PARMS分子標記Hd6Kasa－PARMS，并利用該標記對以‘蜀恢498’為供體親本、‘蘇秀867’為輪回親本構(gòu)建的BC2F2群體進行基因型鑒定，可以準確高效地鑒定出Hd6Kasa基因型，為培育具有優(yōu)良生育期和適應性的栽培水稻品種提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘蜀恢498’是具有高配合力優(yōu)質(zhì)的水稻恢復系材料，作為重穗型骨干親本，基因資源豐富，熟期適當，適宜于我國秈稻區(qū)種植?！毡厩纭堑湫偷木静牧希Ｗ鳛榛A研究的對照和受體?！K秀867’是黃淮稻區(qū)粳型常規(guī)水稻，在產(chǎn)量品質(zhì)及抗病性等方面表現(xiàn)比較均衡，適合種植于山東南部、沿淮及淮北地區(qū)?！?311’是秈稻代表性品種，具有較為完善的基因組數(shù)據(jù)庫，常作為秈稻基礎研究對照。供試水稻材料均種植于濟南市歷城區(qū)飲馬泉實驗站，常規(guī)大田水肥管理。

1.2 水稻葉片DNA的提取

取幼嫩的水稻葉片于2 mL離心管中，參考凌飛等[20]的CTAB法提取葉片DNA。

1.3 引物設計與PCR反應

根據(jù)目的SNP位點開發(fā)了一個分子標記Hd6Kasa－PARMS，根據(jù)目的SNP位點上下游共129 bp的DNA序列設計了3條標記引物，包括兩條正向特異性引物Hd6Kasa－PARMS－FAM(5′－GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGAGGTCCAAA CATTGTGT－3′)和Hd6Kasa－PARMS－HEX(5′－GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGAGGTCCAAA CATTGTGA－3′)及一條反向通用引物Hd6Kasa－PARMS－common(5′－TCATAATCTGTCAACGTGGGGTAC－3′)，其中FAM的標簽序列為GACCAAGTTCATGCT，HEX的標簽序列為CGGAGTCAACGGATT。引物由擎科生物科技有限公司合成。

PARMS－PCR擴增體系(10μL):94℃預變性15 min；94℃變性20 s，65℃(每循環(huán)下降0.8℃)退火及延伸1 min，擴增10個循環(huán)；94℃變性20 s，57℃退火及延伸1 min，擴增28~30個循環(huán)。產(chǎn)物用QuantStudio 5熒光定量PCR儀的Genotyping模式采集FAM和HEX熒光信號值并自動進行基因分型。

常規(guī)PCR擴增體系(20μL):94℃預變性5 min；94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；72℃延伸2 min，12℃保存。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠回收，純化后送至擎科生物科技公司測序。引物為Hd6－F(5′－ATGGGGTGAGCAGGATGACT－3′)和Hd6－R(5′－CGTGGGGTACAGCACTTTGA－3′)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PARMS標記的開發(fā)與應用結(jié)果

已知‘Kasalath’與‘日本晴(Nipponbare)’的Hd6等位基因存在一個堿基替換(A436－T436)，而正是這個堿基的改變，導致兩個基因型的功能發(fā)生質(zhì)的改變[8，13]。通過測序比對發(fā)現(xiàn)，‘蜀恢498’與‘Kasalath’Hd6基因序列的堿基序列一致，SNP位置均為A；而‘蘇秀867’與‘日本晴’的一致，均為T(圖1A)。利用‘蜀恢498’為供體親本、‘蘇秀867’為輪回親本構(gòu)建BC2F2群體，為了篩選出該BC2F2群體中攜帶抽穗期基因Hd6Kasa的品系，在該SNP位點處設計了一個PARMS分子標記Hd6Kasa－PARMS(圖1B)。從BC2F2群體中選取50個單株，利用Hd6Kasa－PARMS標記進行基因分型，結(jié)果(圖1C)顯示，利用該標記可很好地區(qū)分開Hd6基因分型，相同基因分型的聚為一類，其中，17個單株基因型與供體親本相同，即圖中的藍點樣本；22個為雜合子，即圖中的綠點樣本；11個與輪回親本基因型相同，即圖中的紅點樣本。上述結(jié)果表明篩選出的39個攜帶QTL位點Hd6Kasa的單株可作為育種中間材料，繼續(xù)擴大種植和篩選。

圖1 分子標記Hd6Kasa－PARMS的開發(fā)與利用

2.2 群體基因型的測序驗證

為了進一步驗證PARMS標記的特異性，對50份BC2F2樣品進行PCR擴增和Sanger測序。序列比對結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，有17份樣品SNP位點處堿基為A且為單峰，與‘Kasalath’的基因型一致；有11份樣品SNP位點處堿基為T且為單峰，與‘日本晴’的基因型一致；22份樣品SNP位點處堿基顯示為A/T且雙峰，為雜合基因型。這與利用PARMS標記得到的基因分型結(jié)果一致(圖1、表2)。說明Hd6Kasa－PARMS標記能非常精準地從群體中篩選出攜帶抽穗期基因Hd6Kasa的個體。

表1 BC2F2群體SNP位點的測序分型結(jié)果

表2 Hd6Kasa－PARMS與DNA測序基因分型結(jié)果對應

2.3 群體基因型和抽穗期表型的相關性分析

為了闡釋Hd6基因的功能和開發(fā)標記的必要性，對BC2F2群體各單株的抽穗期進行統(tǒng)計，結(jié)果(表1)顯示，‘Kasalath’基因型的17個單株平均抽穗時長為155 d左右，雜合型的22個單株平均抽穗時長為143 d左右，‘日本晴’基因型的11個單株平均抽穗期為145 d左右。利用SPSS 26.0軟件對抽穗期表型與Hd6基因分型的量化數(shù)據(jù)進行處理，將Hd6Kasa基因型設置為數(shù)字0，Hd6Nip基因型以及雜合型設置為數(shù)字1，結(jié)合50份單株的抽穗期調(diào)查，對基因型與表型進行相關性分析，結(jié)果顯示，兩者相關系數(shù)為0.858(P<0.01)，達到極顯著水平，說明水稻抽穗期表型與Hd6基因型密切相關。長日照條件下，Hd6Kasa基因型的導入能有效改變水稻的抽穗期。

3 討論與結(jié)論

選育具有理想抽穗期的水稻品種是實現(xiàn)特定產(chǎn)區(qū)增產(chǎn)的關鍵。在常規(guī)育種工作中，育種家們會盡量選擇生育期合適的株系；而在雜交育種過程中，各組合抽穗期的測定耗時耗力，尤其由秈粳交組合中選育的品種抽穗期普遍較晚，無法準確選育出抽穗期適合的品種，很大程度上限制了水稻亞種間雜種優(yōu)勢的利用。在過去的幾十年里，大量的抽穗期基因及其等位基因型被挖掘分析，為選育理想抽穗期的品種提供了有力條件。當前分子標記輔助選擇、基因工程調(diào)控以及基因編輯技術均可有效利用抽穗期相關的基因資源，培育熟期合適的栽培品種。其中，分子標記輔助育種相對于傳統(tǒng)的育種方法，具有高效便捷的優(yōu)勢，且不受外界環(huán)境條件的干擾，是目前應用最廣泛的育種方法之一[18]。Hd6基因編碼區(qū)存在一個堿基替換，引起的自然變異導致水稻抽穗期調(diào)控功能上的秈粳分化，同時Hd6能精調(diào)水稻抽穗期的晝夜臨界時長，其功能多樣性使其具有重要的育種應用價值。

與早期傳統(tǒng)的分子標記相比，PARMS標記更加高效、準確、快速及高通量，只需進行PCR擴增即可完成檢測，且試驗成本與傳統(tǒng)方法差別不大。本研究即基于高通量的PARMS標記檢測技術，以Hd6Kasa和Hd6Nip之間的SNP位點開發(fā)了Hd6Kasa－PARMS標記，利用該標記可以準確區(qū)分出Hd6基因分型，能從以‘蜀恢498’為供體親本、以‘蘇秀867’為輪回親本獲得的BC2F2群體中篩選出攜帶抽穗期基因Hd6Kasa的單株，經(jīng)Sanger測序驗證，準確率高達100%。綜上所述，利用Hd6Kasa－PARMS標記可快速準確篩選出攜帶Hd6Kasa基因的株系，這有利于充分發(fā)揮抽穗期調(diào)控基因Hd6在水稻育種中的應用價值，提高育種效率，為高效培育抽穗期理想的水稻品種提供了方法。