陳驍昱,吳 憂,雷佳樂,李佳柯,孫文艷,章華偉

(浙江工業(yè)大學 藥學院,浙江 杭州 310014)

微生物次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)豐富且生物活性多樣,在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,是天然藥物先導物的重要來源[1-2],然而野生菌株來源的先導物含量低、組分雜,嚴重影響其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。核糖體工程是一種通過靶向核糖體的抗生素引入耐藥性突變來調(diào)節(jié)核糖體成分(核糖體蛋白或rRNA),從而增加微生物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的技術(shù),主要以核糖體和RNA聚合酶為靶目標進行修飾和改造,通過產(chǎn)生抗生素抗性突變誘導微生物核糖體結(jié)構(gòu)的改變,從而引起胞內(nèi)基因表達以及蛋白合成能力的改變,進而影響其次級代謝產(chǎn)物的生物合成能力。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的選育,如放線菌[3]、桿菌[4-5]和真菌[6]等,不僅能有效提高目標先導物的生產(chǎn)效價,而且能高效挖掘新型次級代謝產(chǎn)物。

筆者系統(tǒng)梳理了核糖體工程技術(shù)用于選育優(yōu)質(zhì)菌株的相關(guān)研究報道,綜述了不同誘變方式包括單抗生素誘變、多抗生素誘變和復合誘變的研究進展,為核糖體工程的發(fā)展以及微生物優(yōu)質(zhì)菌株的選育提供參考。

1 單抗生素誘變

微生物通常在進入生長穩(wěn)定期后開始合成次級代謝產(chǎn)物,其次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的表達決定于核糖體,核糖體除表達基因合成蛋白外,還存在多種調(diào)節(jié)生長代謝的重要位點和多種抗生素結(jié)合位點?？股乜剐詸C制研究表明:如利福平(Rifampicin,Rif)、鏈霉素(Streptomycin,Str)、慶大霉素(Gentamicin,Gen)、巴龍霉素(Paromomycin,Par)、夫西地酸(Fusidicacid,Fus)、新霉素(Neomycin,Neo)、氯霉素(Chloramphenicol,Chl)、四環(huán)素(Tetracycline,Tel)、林可霉素(Lincomycin,Lin)、紅霉素(Erythromycin,Ery)和卡那霉素(Kanamycin,Kan)等抗生素能使微生物產(chǎn)生類似應(yīng)急反應(yīng)的現(xiàn)象,從而改變核糖體結(jié)構(gòu),影響微生物次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控途徑,并能定向提高目標產(chǎn)物合成能力[7-8]。在單抗誘變中,氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素不僅誘變效果好,而且應(yīng)用廣泛。

1.1 氨基糖苷類

1.1.1 鏈 霉 素

鏈霉素是核糖體工程中最常用的抗生素之一,其作用位點通常是30S核糖體(核糖體小亞基)上的rpsL基因,該基因編碼核糖體蛋白S12。Shima等[9]發(fā)現(xiàn)rpsL基因突變導致S12蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而使鏈霉素不能與S12結(jié)合,最終讓突變菌株表現(xiàn)為對鏈霉素抗性。這種突變機制同時會使核糖體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,翻譯的保真度更高[10]。rpsL基因突變不僅激活了變鉛青鏈霉菌(S.lividans)產(chǎn)生放線菌素的基因,而且規(guī)避了天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)中relA和brgA突變以及灰色鏈霉菌(S.griseus)中relC突變的影響。因為通過研究發(fā)現(xiàn)鏈霉素引起核糖體改變的機制其實與其濃度存在一定的關(guān)聯(lián),所以目前鏈霉素引起核糖體改變的機制主要分為2種:高水平耐藥性是由rpsL突變引起的;而低水平耐藥性是由rsmG突變引起的,rsmG編碼1個包含SAM結(jié)合基序的16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶[7]。大量研究表明鏈霉素引起的突變會提高一些菌株的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。Zhuang等[11]采用鏈霉素對CB03234菌株(Streptomycessp.CB03234)進行改良,成功篩選出1株30S核糖體蛋白S12發(fā)生K43N突變的天賜霉素(TNMs)高產(chǎn)鏈霉菌CB03234-S(Streptomycessp.CB03234-S)。在放大發(fā)酵過程中,TNM-A和TNM-A/D的效價分別提高了45倍和100倍,使TNM-A和TNM-D的制備量超過200 mg;劉華華等[12]采用鏈霉素對綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridochromogenesgs 77)進行抗性選育,獲得了1株阿維拉霉素高產(chǎn)突變菌株S.viridochromogenesgs 77-54,其阿維拉霉素的產(chǎn)量為原始菌株的1.8倍,且突變菌株的氣生菌絲呈長直形,較為粗壯,孢子為直徑約1.1 μm×0.6 μm的橢圓形,與出發(fā)菌株區(qū)別明顯;李芹等[13]通過逐步引入高濃度鏈霉素的方法篩選到了1株高產(chǎn)ε-聚賴氨酸(ε-Poly-L-lysine,ε-PL)突變株SS-19(S.albulusSS-19),產(chǎn)量達(3.13±0.04) g/L,比原始菌株提高了95.63%;韓曉等[14]以海洋來源無活性放線菌野生株HLF-39和HLF-43為出發(fā)菌,分離純化鏈霉素抗性突變株,通過抗腫瘤活性篩選獲得抗腫瘤活性突變株,從HLF-43突變株CHS-21101發(fā)酵物中分離得到2個該突變株新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物,并分別鑒定為環(huán)(4-羥脯-亮)二肽和phencomycin,從而拓展藥源放線菌活性菌株新資源。

1.1.2 慶大霉素

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素,其抗性通常是通過菌體的rplF基因發(fā)生突變產(chǎn)生的,rplF基因負責編碼30S核糖體中的L6蛋白。L6蛋白位于肽基轉(zhuǎn)移酶中心的氨酰-tRNA結(jié)合位點,直接與23S rRNA結(jié)合。當微生物菌株的relA基因發(fā)生突變時,雖然菌體不能合成ppGpp,其次級代謝產(chǎn)物也不能生產(chǎn),但是在relA突變株中引入rplF基因突變,獲得慶大霉素抗性后,發(fā)現(xiàn)突變株在ppGpp合成能力沒有恢復的情況下也恢復了產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的能力,這說明L6蛋白的突變可不依賴ppGpp啟動次級代謝產(chǎn)物的合成?；谠撛?慶大霉素也逐漸被用于提高微生物菌株的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[10]。Wang等[15]通過核糖體工程技術(shù)獲得了具有慶大霉素抗性的楊浦分枝桿菌DSM 45577菌株(MY-G-1),突變菌株顯示出較高的YPMs產(chǎn)量(7.4 mg/L),成功解決了野生型楊浦分枝桿菌因YPMs產(chǎn)量低(1 mg/L)而阻礙進一步藥物開發(fā)的問題。

1.1.3 巴龍霉素

巴龍霉素的抗性是通過編碼30S核糖體S12蛋白的rpsL基因保守區(qū)域的突變,將其第314位的C突變?yōu)锳,由脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０?第320位的C突變?yōu)門,由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸來產(chǎn)生的。鄔洋等[16]在10×MIC(最小抑菌濃度)巴龍霉素濃度下,分離得到糖多孢菌的巴龍霉素抗性突變株54株,其中突變體P-7(S.pogonaP-7)的丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍;Liu等[17]使鏈霉菌M-Z18(S.albulusM-Z18)獲得巴龍霉素的抗性,抗性突變體的次級代謝產(chǎn)物(ε-聚L-賴氨酸)產(chǎn)量達到了2.59 g/L,較原始菌株產(chǎn)量提高了1.45倍。

1.2 大環(huán)內(nèi)酰胺類

利福平是一種大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素,作用于菌體RNA聚合酶的β亞基,能抑制細菌DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA,干擾脫氧核糖核酸及蛋白質(zhì)的合成,從而達到滅菌的目的。利福平的作用機制通常是誘導菌體的rpoB基因發(fā)生突變,該突變除了能提高抗生素產(chǎn)量外,還會使RNA聚合酶(RNAP)亞單位中產(chǎn)生某些RPOBM突變(以及核糖體蛋白S12中產(chǎn)生的某些RPSLS突變),這對激活“沉默”次級代謝物生物合成基因有效,最終可能會導致新抗生素的產(chǎn)生。rpoB突變在促進各種放線菌產(chǎn)生抗生素方面廣泛有效,并且其激活了次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇,這些基因簇是“沉默的”或在普通培養(yǎng)條件下表達差。rpoB突變在增強抗生素鏈球菌(S.antibiocus)中的放線菌素產(chǎn)量方面有效,但在微小鏈球菌中無效,這表明rpoB突變效應(yīng)的菌株依賴性。該利福平耐藥突變方法的特點是其具有可行性,不僅有助于激活和提高代謝物的產(chǎn)量,而且可用于發(fā)掘代謝物的生物化學活性[18]。劉正強[19]研究發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性細菌熒光假單胞Pf-5(P.protegensPf-5)中引入rpoB基因突變,會導致突變株的代謝水平與原始菌相比有較大差異,突變株R55(P.protegensR-55)的多個代謝產(chǎn)物產(chǎn)量都有一定提高。對出發(fā)菌株P(guān)f-5和利福平突變菌株進行DNA序列分析,發(fā)現(xiàn)7個抗真菌活性提高的突變菌株都發(fā)生了相同的位點突變,在rpoB基因的保守區(qū)(rif-clusterI)存在點突變(H53IN)。Thong等[20]從11株放線菌出發(fā),共篩選出164個Rif突變體,并鑒定出1株具有rpoBH437Y突變的TW-R50-13,在TW-R50-13中分離出大量的次級代謝產(chǎn)物,經(jīng)過結(jié)構(gòu)分析確定其主要成分為3種含甲苯的線性聚酮。使用相同的方法在9種放線菌中共篩選出114Rif突變體,并鑒定出1個鏈霉菌序列S55-50-5,具有相同的rpoBH437Y突變,經(jīng)鑒定該菌株產(chǎn)生了一種新型的對受試腫瘤細胞系具有細胞毒性和對金黃色葡萄球菌有抗菌活性的四環(huán)聚酮異吲哚霉素。徐祖?zhèn)サ萚21]采用利福平對S.albulusFMME-545進行改良,最終獲得了次級代謝產(chǎn)物(ε-聚賴氨酸)產(chǎn)量可達2.42 g/L的突變菌株,較原始菌株產(chǎn)量提高了1.73倍。核糖體工程常用的抗生素如圖1所示。

圖1 核糖體工程常用抗生素Fig.1 The most common antibiotics used in ribosome engineering

2 多抗生素誘變

近年來,復合抗生素的使用也成為運用核糖體技術(shù)提高菌株的次級代謝產(chǎn)物的常用方法之一。基于經(jīng)典的核糖體工程研究方法,在菌株中依次引入不同類型的抗生素突變能夠非常有效地提高其抗生素產(chǎn)量,該方法在提高某些菌株的次級代謝產(chǎn)物方面較使用單一抗生素有著更加顯著的效果,并且在產(chǎn)量的提升作用上具有“疊加效應(yīng)”。此外,誘導聯(lián)合耐藥突變還可能會產(chǎn)生高頻率的陽性突變。

2.1 雙抗生素

為提高野生菌株的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量,研究者們基于核糖體工程菌株選育理念,利用2種抗生素抗性篩選的方法獲得高產(chǎn)突變株。Hu等[22]在鏈霉菌突變體中引入慶大霉素和利福平抗性構(gòu)建雙突變體(str-gen和str-rif),進一步提高了天藍色放線菌合成放線菌素的產(chǎn)量(約1.7～2.5倍),并通過Western印跡分析,確定在這些雙突變體中通路特異性調(diào)控蛋白ActII-ORF4的產(chǎn)量顯著增加;吳光耀等[23]以1株經(jīng)過多輪原生質(zhì)體融合和常壓等離子體誘變改造菌S.albulusAS3-14為出發(fā)菌,通過相繼使用鏈霉素和利福平進行抗性篩選,獲得了雙重抗性高產(chǎn)突變株S.albulusWG-608,其ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量達到3.7 g/L,5 L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵ε-聚賴氨酸產(chǎn)量達到53.0 g/L,較出發(fā)菌株分別提高了42.3%和32.5%;王耀耀等[24]采用鏈霉素和利福平對東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientails)進行二輪組合誘變,得到一系列具有多樣代謝特點的菌株,其中04-102發(fā)酵水平較原出發(fā)菌株提高45.8%,發(fā)酵水平達到145.8 ug/mL,且代謝速度和遺傳穩(wěn)定性都得到顯著改善;Campbell等[25]采用利福平和慶大霉素對多黏擬桿菌OSY-DF(PaenibacilluspolymyxaOSY-DF)進行2輪抗性篩選,獲得了效價比野生型高出5倍的芽孢桿菌素高產(chǎn)菌株OSY-EC,該菌株具有良好的穩(wěn)定性和自發(fā)性。

2.2 多抗生素

在雙重抗生素抗性篩選的基礎(chǔ)上,多重抗生素抗性誘變篩選被廣泛使用。Hu等[22]在發(fā)現(xiàn)了天藍色放線菌雙突變體(Str-Gen和Str-Rif)的高產(chǎn)量后構(gòu)建了三重突變體(Str-Gen-Rif),發(fā)現(xiàn)其具有更高的抗生素生產(chǎn)能力(3.5倍),能夠生產(chǎn)比野生型菌株多48倍的放線菌素,且三重突變體產(chǎn)生的放線菌素持續(xù)時間(4 d)比單一或雙突變體(2 d)長;Wang等[26]通過對藍鏈霉菌A3(S.coelicolorA3)連續(xù)引入多個耐藥突變來獲得抗生素高產(chǎn)的菌株,并篩選出分別對7種和8種藥物具有耐藥性的突變體C7和C8,其聚酮類抗生素放線菌素的產(chǎn)量比野生型高出180倍,證明七元和八元耐藥突變能顯著激活抗生素生產(chǎn);湯谷[27]在獲得高產(chǎn)突變菌株T3-145(S.diastatochromogenesT3-145)后,使用鏈霉素、利福平和巴龍霉素對其進行5輪高產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性突變株的篩選,得到1株高產(chǎn)突變株G5-59(S.diastatochromogenesG5-59),其四霉素P的產(chǎn)量為3 131 mg/L,是野生型菌株的40倍,四烯菌素B的產(chǎn)量為1 033 mg/L,是野生型菌株的29倍,四霉素A的產(chǎn)量為768.9 mg/L,是野生型菌株的13倍;Shentu等[28]對S.diastatochromogenes1628引入多重抗性獲得三重抗性突變株SD3145(Str Str Par),發(fā)酵優(yōu)化后其豐加霉素的產(chǎn)量最高達2 664 mg/L,可用于改善豐加霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。

3 復合誘變

單因子誘變雖然有一定的效果,但是往往不夠理想。多因子復合誘變能從不同角度引起菌株遺傳物質(zhì)的改變,具有“疊加效應(yīng)”[16],將核糖體工程與基因編輯技術(shù)[29]和發(fā)酵優(yōu)化[30]方法相結(jié)合可以更高效地提高誘變效率和菌株產(chǎn)量。

3.1 雙重復合法

將傳統(tǒng)的理化因子誘變育種方法與抗性基因突變篩選結(jié)合,通過大幅度淘汰野生型并濃縮突變型來提高篩選效率,可以在很大程度上克服誘變隨機篩選的盲目性和不定向性,具有廣譜性、正突變率和增產(chǎn)百分率高等特點[31]。鄭根成等[32]借助基因組重排和核糖體工程兩種育種手段強化ε-PL產(chǎn)生菌的合成能力,最終經(jīng)過4輪基因組重排和4輪核糖體工程連續(xù)選育,獲得1株高產(chǎn)突變株S.albulusGS114,其搖瓶ε-PL產(chǎn)量達到3.0 g/L,較出發(fā)菌提高了1.7倍;劉娟娟等[33]通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了沒有任何抗性標記的新型CAM工程菌株54IA-1(S.spiramyceticus54IA-1)和54IA-2(S.spiramyceticus54IA-2),并進一步通過核糖體工程技術(shù)對構(gòu)建成功的CAM工程菌株進行菌種誘變,篩選獲得新型可利霉素(Carrimycin,CAM)高產(chǎn)菌株,為CAM工程菌株的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ);喬長晟等[34]以刺糖多孢菌GYLZ 88912為出發(fā)菌,采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變,并通過核糖體工程篩選出1株具有磺胺胍、利福平、鏈霉素和紅霉素多重抗性的高產(chǎn)菌,其多殺菌素的產(chǎn)量為2 361.81 mg/L,較出發(fā)菌株提高了286.71%;Li等[35]采用基因重組與多種抗生素耐藥性相結(jié)合的育種方法,從小單胞桿菌LS-1(BacilluspumilusLS-1)出發(fā),在第三輪重組中獲得了高產(chǎn)菌株GS3-M7,并在后續(xù)發(fā)酵中測得其聚-L-二氨基丁酸產(chǎn)量達2 316.4 mg/L;鄭明坤等[36]首先通過鏈霉素抗性篩選,獲得1株產(chǎn)抗能較高菌株,以等離子體處理40 s,借助巴龍霉素抗性篩選后,重復誘變篩選最終獲得1株MicromonosporainyoensisSAAP22,其西索米星合成能力比出發(fā)菌株效價提高了38.18%,且具有穩(wěn)定的遺傳性能。

3.2 多重復合法

多重復合法可更有效地進行誘變并獲得目標菌株。石漫漫等[37]以通過常壓室溫等離子體誘變篩選出的高產(chǎn)游動放線菌為出發(fā)菌株,首先進行紫外誘變并聯(lián)合核糖體工程進行誘變;然后進行發(fā)酵復篩;最后得到的游動放線菌的雷帕霉素產(chǎn)量可達到589.79 mg/L,較出發(fā)菌株的產(chǎn)量256.86 mg/L提高了129.61%,且遺傳穩(wěn)定性良好。Tong等[38]通過對維吉尼亞鏈霉菌進行紫外線照射和微波照射產(chǎn)生起始突變體群體,再通過連續(xù)5輪基因組重組聯(lián)合鏈霉素耐藥性篩選,獲得了基因表達穩(wěn)定的菌株G5-103(S.virginiaeG5-103),其鏈霉菌維吉霉素(VGM)產(chǎn)量達251 mg/L,是野生型菌株CICC11013(S.virginiaeCICC11013)的11.6倍。王欣榮等[39]以游動放線菌SIIA-1602(ActinoplanesSIIA-1602)作為出發(fā)菌株,將NTG誘變、核糖體工程育種和常壓室溫等離子體方法結(jié)合,篩選得到突變株ASN-256(ActinoplanesASN-256),發(fā)酵效價達到615 μg/mL,比出發(fā)菌株提高了55.7%。Li等[40]結(jié)合紫外線誘變、核糖體工程以及發(fā)酵優(yōu)化等,從鏈霉菌DengpaensisXZHG99T出發(fā)獲得了4個鏈霉素突變體,并通過基因篩選、HPLC/LC-MS分析后獲得高產(chǎn)菌株,其拉貝霉素和沙奎霉素B1的最大效價分別達到15.7,39.9 mg/L,比XZHG99T的初始效價分別高出約8倍(拉貝霉素)和11倍(沙奎霉素B1)。近5年來利用核糖體工程技術(shù)提高目標產(chǎn)物效價的研究情況如表1所示。

表1 利用核糖體工程技術(shù)提高目標產(chǎn)物效價情況表(2017—2021年)

4 結(jié)論與展望

核糖體工程技術(shù)操作雖然簡單且應(yīng)用廣泛,但仍然存在許多不足,主要表現(xiàn)為2個方面:一是相較于傳統(tǒng)的物理和化學誘變方法,核糖體工程作用靶點雖然更加明確,但仍然存在著一定的隨機性,相同的突變對不同的產(chǎn)物也可能有相反的影響,因此,不可避免地需要進行繁雜且冗長的抗性誘變以及篩選等;二是目前大多數(shù)抗生素的作用靶點和具體改變微生物次級代謝能力的機制仍比較模糊,缺少系統(tǒng)的相關(guān)研究和機理模型,導致核糖體工程效率較低。因此,核糖體工程技術(shù)仍有待進一步的發(fā)展完善,可通過發(fā)掘更多可用抗生素、深入解析抗生素的作用機制及確定對應(yīng)的作用靶點、利用菌株基因組信息為指導快速篩選目標突變菌株等方法來實現(xiàn)。在后基因組時代,分析技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用,越來越多微生物合成次級代謝物的巨大潛力被發(fā)現(xiàn),綜合運用核糖體工程、基因工程和生物信息學等技術(shù)必將促進優(yōu)質(zhì)菌株的高效選育,并提高其次級代謝產(chǎn)物的合成能力。