韓丹 羅超迪 閆煬

心房顫動(dòng)（房顫）與心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)是間質(zhì)纖維化[1]。微小RNA（miRNA）是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子，在多種疾病的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)，尤其在房顫心房纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。大多數(shù)房顫相關(guān)miRNA如miR-26、miR-29、miR-133、miR-590 等在心房組織中表達(dá)下調(diào)，活化相關(guān)通路，促進(jìn)心房肌間質(zhì)發(fā)生纖維化[4-6]。本研究旨在明確有單純二尖瓣病變的風(fēng)濕性心臟?。L(fēng)濕性二尖瓣疾?。┗颊咝姆拷M織的主要病理變化，并通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選與風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫心房纖維化相關(guān)的miRNA 及其靶基因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2019 年1 月至2021 年1 月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的30 例風(fēng)濕性二尖瓣疾病患者，根據(jù)患者心電圖結(jié)果，分為竇性心律組10 例，房顫組20 例。所有患者均在我院心臟外科進(jìn)行單純二尖瓣瓣膜置換手術(shù)及房顫迷宮手術(shù)，術(shù)中取左心耳組織。記錄患者的臨床資料，術(shù)中收集的心耳組織標(biāo)本用于病理學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)及生物信息學(xué)分析。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批件號(hào)：2021 倫審科字第（025）號(hào)（No.XJTU1AF2021LSK-025），所有入選者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 蘇木精-伊紅染色

將新鮮左心耳組織于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，脫水后浸泡于二甲苯中進(jìn)行透明化處理，石蠟包埋、切片、烘干、脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后脫水、封片。顯微鏡下觀察心房組織的心房肌結(jié)構(gòu)、脂肪浸潤(rùn)等現(xiàn)象。

1.3 Masson染色

將脫水后的左心耳組織石蠟切片依次放入鐵蘇木素、麗春紅、磷鉬酸、苯胺藍(lán)中染色，冰醋酸沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察心房組織的纖維化程度，ImageJ 軟件計(jì)算間質(zhì)纖維化程度。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

將左心耳石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脫蠟，H2O2浸泡，檸檬酸緩沖液蒸煮，PBS 沖洗，BSA 封閉，加入α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）一抗于4 ℃過(guò)夜，沖洗后加入二抗于37 ℃孵育0.5 h，沖洗后依次加入鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）、顯色劑，蘇木精復(fù)染，脫水、封片。顯微鏡下觀察α-SMA 表達(dá)情況，ImageJ 軟件計(jì)算α-SMA 相對(duì)表達(dá)量。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

Trizol 法提取左心耳組織中總RNA，純化并定量。反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。PCR 反應(yīng)體系：2 μL cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，10 μL SYBR Green Master Mix，6 μL dd H2O。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCT計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR 中使用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR中使用的引物序列

1.6 Western blot檢測(cè)

RIPA 裂解液提取左心耳組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）、α-SMA、蛋白激酶Cα（PRKCA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β Ⅱ型受體（TGFβRⅡ）、磷酸化Smad2（P-Smad2）、磷酸化Smad3（P-Smad3）、Smad2、Smad3、β-actin 的一抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。ECL 法曝光，成像，Quantity One 分析軟件測(cè)定目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

分別構(gòu)建與miR-647 結(jié)合的PRKCA基因野生型3'UTR 區(qū)目的質(zhì)粒（PRKCA-wt）及PRKCA基因突變型3'UTR 區(qū)目的質(zhì)粒（PRKCA-mut），miR-647 擬似物（miR-647）及陰性對(duì)照擬似物（NC mimics）。將10 μL DMEM 與0.16 μgPRKCA-wt或PRKCA-mut 目的質(zhì)粒及5 pmol/L miR-647 或NC mimics 充分混勻后（溶液A）室溫放置，之后將10 μL DMEM 與0.3 μL 的轉(zhuǎn)染試劑（濃度為0.8 mg/mL）充分混勻后（溶液B）室溫放置5 min。將溶液A 與溶液B 充分混勻后加入293T 細(xì)胞中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h 后換取新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，使用Promega Dual-Luciferase System 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞裂解液于4 ℃，12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，取上清；96 孔板中加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液與20 μL 細(xì)胞裂解液，混勻并測(cè)定記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶值，此值為內(nèi)參值。上述96 孔板中繼續(xù)加入100 μL Stop &Glo?Reagent，混勻并測(cè)定記錄海腎熒光素酶值，此即為報(bào)告基因發(fā)光值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Student'st檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床基線資料比較

2 組患者在性別構(gòu)成、紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)、收縮壓、舒張壓、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、右心房直徑（RAD）等的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。房顫組的年齡、房顫持續(xù)時(shí)間、左房直徑（LAD）顯著高于竇性心律組（P均＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 竇性心律組與房顫組臨床基線資料比較

2.2 2組患者左心房組織形態(tài)學(xué)比較

HE 染色顯示，竇性心律組心房肌組織排列整齊，脂肪浸潤(rùn)少，房顫組心房肌組織結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞間脂肪浸潤(rùn)現(xiàn)象更明顯。Masson 染色顯示，竇性心律組心房肌組織間質(zhì)纖維化程度輕，膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）為11.75±1.54，房顫組心房肌組織間質(zhì)纖維化程度高，CVF 為33.52±1.41，2 組CVF比較有顯著性差異（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)染色顯示房顫組心房肌組織纖維化表型相關(guān)蛋白α-SMA 的平均光密度（AOD）顯著高于竇性心律組（0.39±0.01 對(duì)0.23±0.01，P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 2組患者左心房組織形態(tài)學(xué)比較（×200）

2.3 2組纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平比較

房顫組左心房組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于竇性心律組（P均＜0.01）。見(jiàn)圖2、表3。

表3 2組患者左心房纖維化相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

圖2 2組患者左心房纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 2組TGFβ1/Smad纖維化相關(guān)通路表達(dá)水平比較

房顫組左心房組織TGFβ1/Smad 纖維化通路中TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于竇性心律組（P均＜0.01）。見(jiàn)圖3、表5。

圖3 2組患者左心房TGFβ1/Smad纖維化通路蛋白表達(dá)情況

2.5 差異表達(dá)的miRNA及其靶基因預(yù)測(cè)

前述結(jié)果提示心房纖維化是風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病的主要病理改變。為了研究miRNA 及其靶基因在房顫心房纖維化中的作用，本研究進(jìn)一步通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件TargetScan 和Tarbase 數(shù)據(jù)庫(kù)分析可能與房顫相關(guān)的靶基因。篩選到的靶基因有10 個(gè)，對(duì)應(yīng)的miRNA 為19 個(gè)。既往文獻(xiàn)調(diào)查顯示PRKCA基因與組織纖維化進(jìn)程有關(guān)，且未有該基因在房顫相關(guān)研究中的報(bào)道，PRKCA對(duì)應(yīng)的miR-647 的預(yù)測(cè)分值較高（91 分），且qRT-PCR 及Western blot 驗(yàn)證房顫患者心房組織中miR-647 及PRKCA的表達(dá)符合理論上應(yīng)有的變化趨勢(shì)，說(shuō)明PRKCA基因及其對(duì)應(yīng)的miR-647 與風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病機(jī)制相關(guān)。見(jiàn)圖4、表5。

表5 2組左心房組織PRKCA及miR-647表達(dá)水平比較

圖4 2組PRKCA蛋白表達(dá)情況

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-647靶向作用于PRKCA基因

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，NC mimics＋PRKCA-mut 的相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.00±0.02，miR-647＋PRKCA-mut 的相對(duì)熒光強(qiáng)度 為1.01±0.02，NC mimics＋PRKCA-wt 的相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.00±0.02，miR-647＋PRKCA-wt 的相對(duì)熒光強(qiáng)度為0.64±0.01，miR-647 顯著下調(diào)PRKCA-wt 的熒光強(qiáng)度（P＜0.01），提示miR-647與PRKCA-wt 相互結(jié)合，miR-647 可靶向抑制PRKCA的表達(dá)，其結(jié)合位點(diǎn)如圖5 所示。

圖5 miR-647 與PRKCA 作用靶點(diǎn)示意圖

3 討論

在房顫心房重構(gòu)過(guò)程中，心房組織表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心房肌細(xì)胞壞死、脂肪浸潤(rùn)、淀粉樣變性和心房肌細(xì)胞肥大等，對(duì)這些患者進(jìn)行早期干預(yù)，可延緩纖維化進(jìn)展，減輕心房和心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)，對(duì)房顫治療起積極作用[7]。Haemers等[8]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)房顫患者出現(xiàn)心外膜下脂肪組織浸潤(rùn)，其中間質(zhì)纖維化和脂肪浸潤(rùn)在持續(xù)性房顫患者心房組織中最為常見(jiàn)。本研究對(duì)風(fēng)濕性二尖瓣疾病患者心房組織樣本進(jìn)行HE 和Masson 染色，結(jié)果顯示房顫患者的左心房組織中可見(jiàn)典型的心房肌肥大、脂肪浸潤(rùn)、心房肌細(xì)胞壞死以及大量的間質(zhì)纖維化等病理改變，與既往研究結(jié)果一致，證實(shí)左心房組織纖維化是風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)。

表4 2組患者左心房TGFβ1/Smad纖維化通路基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

房顫心房纖維化的分子機(jī)制復(fù)雜，TGFβ1/Smad 信號(hào)通路活化、Collagen Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)和沉積、纖維化表型相關(guān)α-SMA 的表達(dá)在房顫心房纖維化中發(fā)揮重要作用[9]。本研究在風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫患者的左心房組織中發(fā)現(xiàn)，與TGFβ1/Smad 信號(hào)通路相關(guān)的TGFβ1、TGFβRⅡ、P-Smad2、P-Smad3表達(dá)水平升高，纖維化相關(guān)基因CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的表達(dá)水平也顯著升高，這些纖維化相關(guān)的通路及基因激活后促進(jìn)了房顫的發(fā)生發(fā)展。

蛋白激酶C（PKC）作為G 蛋白耦聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且與多種離子通道的表達(dá)和功能有密切聯(lián)系[10]。蛋白激酶Cα（PKCα）是PKC 的一種亞型，在人類基因組中由PRKCA基因編碼，參與調(diào)控機(jī)體多種生理功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移，并且在心律失常、心肌梗死、心力衰竭、高血壓等多種心臟疾病中發(fā)揮重要作用[11]。Li 等[12]研究人心房肌組織PRKCA突變與心臟疾病的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶rs9909004 等位基因突變影響PRKCA在心臟中的表達(dá)，且與心力衰竭的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)，可能影響心力衰竭的治療效果[13]。既往研究表明，心房肌肥大時(shí)PKCα表達(dá)水平明顯上調(diào)，且PRKCA基因活化可引起QRS 間期延長(zhǎng)，說(shuō)明PKCα 可能同時(shí)參與心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)miRNA 進(jìn)行檢測(cè)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的發(fā)病機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)風(fēng)濕性二尖瓣疾病竇性心律及房顫患者進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，篩選出與風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病相關(guān)的miR-647 及其靶基因PRKCA進(jìn)行研究。通過(guò)回顧文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)于miR-647 的報(bào)道僅限于腫瘤研究。Rawlings-Goss 等[14]采用全基因組測(cè)序法對(duì)14 個(gè)人群（包括歐洲、亞洲和非洲）中69 個(gè)不相關(guān)個(gè)體的1 524 個(gè)miRNA進(jìn)行研究，確定了7 個(gè)與腫瘤生物標(biāo)志物或診斷相關(guān)的miRNA，其中包括miR-647。Liu 等[15]研究結(jié)直腸癌中與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-647 和miR-1914 表達(dá)升高，抑制miR-647 及miR-1914 可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。此外，miR-647在前列腺癌復(fù)發(fā)、卵巢癌預(yù)后中起重要作用[16-17]。既往研究顯示PRKCA基因與組織纖維化進(jìn)程有關(guān)，但尚無(wú)該基因與房顫相關(guān)的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)房顫患者心房組織中miR-647 及PRKCA的表達(dá)符合理論上應(yīng)有的變化趨勢(shì)，故選擇miR-647 及PRKCA作為研究對(duì)象。

本研究明確了心房纖維化是風(fēng)濕性二尖瓣疾病合并房顫患者心房組織的主要病理變化，并對(duì)風(fēng)濕性二尖瓣疾病房顫病理狀態(tài)下miR-647 及PRKCA的表達(dá)情況及靶向作用關(guān)系作進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)miR-647 靶向作用于PRKCA基因，與房顫心房纖維化相關(guān)。miR-647 及PRKCA調(diào)控心房纖維化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索。