呂立銘，高 娟，李大煒，申 茹，毛一中

(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025)

0 引言

黨參來(lái)源于桔?？浦参稂h參[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]、素花黨參[Codonopsis pilosμla Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen]或川黨參[Codonopsis tangshen Oliv.]的干燥根，其性味甘平，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津功效，臨床上常用于治療脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴、內(nèi)熱消渴證[1]。黨參主要成分為聚炔類(lèi)[2-3]、生物堿類(lèi)[4-5]、糖類(lèi)[6-7]、萜類(lèi)[8-9]、木質(zhì)素類(lèi)[10-12]、黃酮類(lèi)[13-14]等，其炮制方法主要有米炒[1]、麩炒[15]、蜜炙[16]、土炒[17]等，此外，還有部分地方采用清蒸方法來(lái)炮制[18-19]。黨參經(jīng)過(guò)清蒸加工成熟黨參后，口感變甜，顏色變黑，原因推測(cè)為5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量增加。據(jù)研究報(bào)道，5-HMF具有多種藥理活性，譬如抗氧化活性[20-21]、改善血液流變學(xué)[22-23]、抗心肌缺血作用[24-25]、降血糖作用[26-27]、抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[25，28]等，但含量超過(guò)一定限度，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。過(guò)量的5-HMF會(huì)損害人體橫紋肌、內(nèi)臟、基因和神經(jīng)等，對(duì)眼睛、皮膚、上呼吸道及黏膜有刺激作用[29-32]。然而，關(guān)于熟黨參中5-HMF的含量測(cè)定研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)高效液相色譜法，創(chuàng)建了熟黨參中5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量測(cè)定方法，希望能為今后黨參的炮制研究和質(zhì)量控制提供思路和方法。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國(guó))，Capcell pak C18色譜柱(資生堂公司，日本，型號(hào)4.6 mm×250 mm，5 μm)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000A(上海越眾儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))，電子天平FA2004N(上海菁海儀器有限公司，中國(guó))，超聲清洗機(jī)PS-40A(深圳市科潔超聲科技有限公司，中國(guó))，BPG-9204A電熱式鼓風(fēng)干燥箱(上海百典儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))；立式萬(wàn)用電爐(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠，中國(guó))。

試藥：黨參(產(chǎn)地：山西晉城市陵川縣六泉鄉(xiāng)廟懷村)藥材經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德教授鑒定，為桔?？浦参稂h參[Codonopsis pilosμla(Franch.)Nannf.]的干燥根，符合2020年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定)，5-HMF對(duì)照品(GC≥98%，批號(hào)：20170519，上海金穗生物科技有限公司，中國(guó))，乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))，甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司，中國(guó))，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：V乙腈∶V水=(5：95)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：常溫(25 ℃)。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取5-HMF對(duì)照品2.8 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻.配成濃度為0.028 mg/mL對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取黨參飲片500 g，置于蒸制容器內(nèi)，隔水蒸2 h至有香甜味時(shí)取出，干燥，得到熟黨參樣品[18]。準(zhǔn)確稱(chēng)取熟黨參樣品粉末(過(guò)二號(hào)篩)0.50 g，置于100 mL錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，靜置1 h后，超聲30 min，再靜置，稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，而后搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取中間部分續(xù)濾液作為供試品溶液，備用[33-34]。

2.3 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣0.5 μl、1μl、2μl、4μl、8μl、10 μl。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=5323.8x-6.6486，(R2=0.9999)。結(jié)果表明，5-HMF進(jìn)樣量在0.014 μg～0.28 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見(jiàn)表1，圖1、2)。

表1 5-HMF線性關(guān)系考察表

圖1 5-HMF對(duì)照品高效液相色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，分別測(cè)定5-HMF峰面積積分值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，對(duì)照品溶液峰面積積分值的平均值為1487.13，RSD值為0.58%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好(見(jiàn)表2)。

圖2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 5-HMF精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取同一批次熟黨參粉末(過(guò)二號(hào)篩)0.50 g，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法，制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別準(zhǔn)確吸取10 μl進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得樣品中5-HMF的平均含量為 4.89 mg/g，RSD值為1.76%(n=6)。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好(見(jiàn)表3)。

表3 5-HMF重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在制備后0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，各進(jìn)樣10 μl，測(cè)得5-HMF峰面積積分值的平均值為 256.58，RSD值為1.12%(n=6)。結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性(見(jiàn)表4)。

表4 5-HMF穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備9份供試品溶液，分別加入一定量的5-HMF對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定5-HMF峰面積積分值，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5-HMF的含量，得到平均加樣回收率為98.91%，RSD值為1.22%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠(見(jiàn)表5)。

表 5 5-HMF加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.8 樣品含量測(cè)定

取收集到的不同批次熟黨參樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，計(jì)算5-HMF峰面積積分值，以峰面積積分值按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5-HMF的含量(見(jiàn)表6、圖3)。

表6 不同批次熟黨參中5-HMF的含量(n=3)

圖3 熟黨參高效液相色譜圖

3 討論

關(guān)于5-HMF安全性評(píng)價(jià)經(jīng)歷了相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，其危害也逐漸被發(fā)現(xiàn)。5-HMF具有多種藥理活性，只有在較高的濃度下才顯示弱毒性，在特定條件下，也可以引起人體某些指標(biāo)發(fā)生一定的變化，但并沒(méi)有造成嚴(yán)重危害。也就是說(shuō)，在常規(guī)的攝入量范圍內(nèi)，5-HMF并不存在嚴(yán)重的安全風(fēng)險(xiǎn)[31-32]。

根據(jù)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，5-HMF的主要來(lái)源有兩條途徑，一是由氨基酸和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成，二是在酸性環(huán)境中，由糖的受熱分解產(chǎn)生，且含量隨著時(shí)間的積累和溫度的升高而增加[34-36]。對(duì)于富含糖類(lèi)成分的中藥，在炮制加工和儲(chǔ)存等過(guò)程中，都會(huì)不可避免地發(fā)生美拉德反應(yīng)和糖的熱降解反應(yīng)(還原糖的分解及蔗糖的焦化)而產(chǎn)生5-HMF[36]。中藥炮制加工是一個(gè)復(fù)雜的成分變化過(guò)程，2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)于米炒黨參炮制品的質(zhì)量要求只要求了性狀檢查，黨參炔苷薄層色譜定性檢查，水分、總灰分、二氧化硫限量檢查和浸出物含量檢查，缺乏具體的藥效成分來(lái)進(jìn)行定量鑒別。鑒于黨參成分復(fù)雜，勢(shì)必造成黨參炮制品質(zhì)量難于控制[36]。

黨參是中醫(yī)傳統(tǒng)的補(bǔ)益類(lèi)中藥，也是我國(guó)常用的藥食同源食材，其在炮制和貯存的過(guò)程中，5-HMF含量會(huì)隨著溫度的升高和時(shí)間的積累而增加。特別是在蒸制過(guò)程中，在水分和熱量的作用下，黨參的顏色加深，5-HMF的含量大幅度增加。鑒于5-HMF對(duì)人體具有潛在的危害，很有必要對(duì)熟黨參中5-HMF的含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究采用 HPLC 法測(cè)定不同批次熟黨參藥材中5-HMF的含量，操作簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好，可以作為熟黨參中5-HMF的測(cè)定方法，能夠?yàn)榻窈簏h參的安全性研究提供參考。