韓昭, 高艷玲, 李志鋒, 張建忠, 張伶, 劉釗, 徐艷艷, 李小靜

1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，2.邯鄲市中心醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002

黑素瘤是一種高轉(zhuǎn)移與高侵襲性的惡性腫瘤，其主要特征是病情進(jìn)展迅速，易侵襲其他組織器官，患者預(yù)后較差，生存率也極低[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是浸潤(rùn)于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞極化為M2型TAMs后調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境和腫瘤免疫反應(yīng)是其發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，自噬則是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的重要條件。有證據(jù)表明，TAMs對(duì)黑素瘤的生長(zhǎng)、血管生成、遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作為重要的細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程之一,在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用。發(fā)生EMT后的上皮細(xì)胞,其表型特性向具有干性、侵襲性、耐藥性及遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移性的方向轉(zhuǎn)化[3],是誘導(dǎo)腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的重要病理學(xué)因素。盡管黑素細(xì)胞并非傳統(tǒng)的上皮成分，但黑素瘤向真皮間質(zhì)侵襲過(guò)程中存在EMT現(xiàn)象。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TanⅡA)為一類脂溶性菲醌化合物，近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)研究顯示TanⅡA可抑制食道癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡和分化，具有良好的抗腫瘤前景[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：Tan Ⅱ A通過(guò)下調(diào)CXCR7表達(dá)抑制黑素瘤A375細(xì)胞的侵襲遷移能力并促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[5]。本研究擬在成功誘導(dǎo)并鑒定TAMs的前提下，通過(guò)TAMs與A375細(xì)胞體外共培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)、免疫熒光、Western blot、遷移侵襲等實(shí)驗(yàn)方法，研究雷帕霉素(Rap)對(duì)TAMs自噬調(diào)控作用及Tan Ⅱ A作用于A375細(xì)胞后對(duì)其EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并了解Tan Ⅱ A通過(guò)TAMs自噬調(diào)控皮膚黑素瘤A375細(xì)胞EMT的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供，完全培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)GIBCO。THP-1由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供，CD68、CD204、CD206一抗購(gòu)自賽默飛，LC3-Ⅱ及Beclin-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam，羊抗兔IgG-HRP及Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Incorporated。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)活化 人惡性黑素瘤細(xì)胞A375、人單核細(xì)胞株THP-1，90%DMEM+10%FBS，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，1×106/孔接種于6孔板，加入PMA(20 ng/mL)，孵育48 h，誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞(M0)。取1個(gè)貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞(M0)的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基中加入IL-4溶液(20 ng/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)M2。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光法鑒定M2巨噬細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分為3組：未經(jīng)任何藥物處理的THP-1細(xì)胞(空白組)；經(jīng)佛波酯(PMA)作用48 h的THP-1細(xì)胞(M0組)；經(jīng)PMA、IL-4序貫作用總計(jì)達(dá)72 h的細(xì)胞(M2組)。①流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：分別收集3組不同條件誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，得到細(xì)胞沉淀，加入90 μL PBS重懸細(xì)胞；按抗體說(shuō)明書(shū)加入適量抗體混勻后，37 ℃避光孵育30 min；加入400 μL PBS混勻，后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，同樣方法對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)3次。②免疫熒光法實(shí)驗(yàn)：向每孔內(nèi)加入Triton X-100，室溫下透膜20 min，加入封閉液封閉細(xì)胞滴加一抗(1∶200稀釋)，4 ℃冰箱過(guò)夜，避光加入相應(yīng)的熒光二抗，加入DAPI溶液，激光共聚焦觀察細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 免疫熒光染色法及免疫印跡法檢測(cè)雷帕霉素對(duì)M2型TAMs自噬的影響 將步驟1誘導(dǎo)后的M2型TAMs分成兩組：空白對(duì)照組(M2組)，即未加任何自噬調(diào)節(jié)藥物；加入雷帕霉素組(M2+Rap組)，置于培養(yǎng)箱中24 h。①24 h后，將各組培養(yǎng)基更換為同樣的沒(méi)有藥物普通培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按免疫熒光步驟制作好細(xì)胞玻片，相繼滴加一抗LC3-Ⅱ(1∶200稀釋)、Beclin-1(1∶200稀釋)和熒光二抗及DAPI后封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存。②24 h后，按細(xì)胞培養(yǎng)方法收集各組細(xì)胞。各加入200 μL冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，每隔5 min渦旋震蕩10 s，充分裂解。取上清液，測(cè)定總蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到NC膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原后，分別加入一抗(1∶1 000稀釋)、二抗，1∶3 000稀釋的GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。使用G:BOX-chemiXR5成像，使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，將各基因和GAPDH比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 TanⅡA作用于A375細(xì)胞與巨噬細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)體系 取一瓶良好生長(zhǎng)狀態(tài)的人黑色素瘤細(xì)胞(A375)，按傳代方法，接種在6孔板內(nèi)，密度約20×104/mL，步驟2中對(duì)THP-1進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得M2巨噬細(xì)胞，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后，以20×104/mL的密度接種于Transwell小室的上室(半透膜孔徑為0.4 μm)中；將該上室放入預(yù)先已接種A375細(xì)胞的6孔板中，構(gòu)建兩者的非接觸共培養(yǎng)體系，并放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。用含10%小牛血清的DMEM制備成2×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，分組加入不同濃度TanⅡA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組為低濃度組(1 mg/L)、高濃度組(4 mg/L)，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，分別處理細(xì)胞48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞的EMT變化 用RIPA試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用二辛可寧酸法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后轉(zhuǎn)入NC膜，室溫下用5%的BSA封閉，分別加入1∶1 000稀釋的單克隆抗體，1∶3 000稀釋的GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，孵育過(guò)夜，用PBS洗滌5次，每次5 min。加入1∶5 000羊抗兔IgG二抗，溫育1.5 h，用TBST清洗4次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。使用G:BOX-chemiXR5成像，使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，將分子和GAPDH比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞侵襲及遷移能力 Matrigel膠用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基1∶1稀釋，按60 μL/孔鋪于Transwell小室的上室面，37 ℃孵育過(guò)夜。每孔加入80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，吸去培養(yǎng)基；將共培養(yǎng)后的A375細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基以5×106/mL濃度按200 μL/孔接種于上層小室，下層小室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入4%甲醛，室溫固定20 min，PBS清洗3次；風(fēng)干后0.3%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察濾膜下表面藍(lán)紫色胞質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)(×400視野)分別拍照、計(jì)數(shù)，取均值。以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移能力實(shí)驗(yàn)步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)，但不需鋪Matrigel膠。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有上述實(shí)驗(yàn)程序獨(dú)立進(jìn)行并重復(fù)3次或以上，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定

人單核細(xì)胞THP-1被PMA刺激作用48 h后分化為M0表型巨噬細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)由懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁，細(xì)胞形態(tài)由類圓形變?yōu)槁圆灰?guī)則并伸出少量偽足;繼續(xù)應(yīng)用IL-4刺激誘導(dǎo)24 h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M2表面分子CD206、CD68、CD204陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(均P<0.05,表1)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M2表面CD206的表達(dá)顯著高于M0組(均P<0.05,圖1)。表明PMA和IL-4連續(xù)刺激能夠成功誘導(dǎo)人單核細(xì)胞THP-1的分化并極化為T(mén)AMs。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TAMs的膜標(biāo)記物CD206、CD68、CD204的表達(dá)情況 (mean±SD)

圖1 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組CD206表達(dá)

2.2 雷帕霉素對(duì)M2型TAMs自噬的影響

免疫熒光發(fā)現(xiàn)，M2型TAMs在去除雷帕霉素刺激后48 h仍能夠維持LC3-Ⅱ、Beclin-1高表達(dá)水平(圖2)，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)雷帕霉素刺激后的TAMs中LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、表2,P<0.05)。

圖2 去除雷帕霉素48 h后，各組M2型TAMs中LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)

圖3 去除雷帕霉素48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表達(dá)水平

表2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)去除雷帕霉素48 h后，各組LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表達(dá)水平 (mean±SD)

2.3 Western blot驗(yàn)證經(jīng)TanⅡA作用后共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞的EMT表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)經(jīng)TanⅡA作用后共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞，結(jié)果顯示(圖4、表3)，相對(duì)于空白組，TanⅡA低濃度組、TanⅡA高濃度組Beclin-1、LC3-Ⅱ和E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)，N-cadherin蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 Western blot檢測(cè)不同TanⅡA濃度組作用后共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞LC3、Beclin1、N-cadherin和E-cadheirn的蛋白表達(dá)比值 (mean±SD)

圖4 Western blot檢測(cè)不同TanⅡA濃度組作用后共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表達(dá)

2.4 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5、表4)，經(jīng)TanⅡA作用后共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞的侵襲、遷移能力降低，且TanⅡA高濃度組處理的細(xì)胞侵襲、遷移能力較低濃度組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度TanⅡA處理A375細(xì)胞的侵襲及遷移

表4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度TanⅡA處理A375細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力 (mean±SD)

3 討論

腫瘤的進(jìn)展伴隨著微環(huán)境的改變，如腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌的趨化因子、細(xì)胞因子和其他因子[6]，以及局部缺氧、炎癥和高水平乳酸的存在，可使血液中的單核細(xì)胞系列被招募到腫瘤微環(huán)境中成為T(mén)AMs[7]，發(fā)育成具有不同免疫防御和免疫監(jiān)視功能的兩大類，即經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)和交替激活的巨噬細(xì)胞(M2)，M1具有促炎和抗腫瘤、防止腫瘤免疫逃逸的作用，M2具有抗炎和促腫瘤、幫助腫瘤免疫逃逸的作用[8]。多數(shù)研究顯示，在已形成的腫瘤體系中，M2型TAMs占比較高，高表達(dá)CD163、CD206并分泌抗炎細(xì)胞因子、管生長(zhǎng)因子等，從而抑制腫瘤微環(huán)境免疫、促進(jìn)腫瘤血管生成[9-10]。流行病學(xué)研究表明，腫瘤微環(huán)境中M2型TAMs浸潤(rùn)數(shù)量與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，提示TAMs參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的M2型TAMs通過(guò)表達(dá)CD11b/CD18來(lái)活化肝癌細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶9信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，腫瘤微環(huán)境中M2表型的TAMs對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程的影響成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。在本研究中，發(fā)現(xiàn)PMA、IL-4對(duì)單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞具有明顯的趨化作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。PMA、IL-4刺激THP-1細(xì)胞48、72 h后，M2型TAMs表型標(biāo)記物CD68、CD206、CD204細(xì)胞的比例增加，提示IL-4在表型和因子兩個(gè)方面促進(jìn)THP-1細(xì)胞的表型向M2型TAMs方向極化。

腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞以自噬為媒介對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響[12],自噬有助于微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞克服代謝壓力,維持其在不良理化環(huán)境中的生存。自噬還參與腫瘤微環(huán)境中TAMs產(chǎn)生的各個(gè)環(huán)節(jié),包括調(diào)節(jié)HSCs持續(xù)分化、單核細(xì)胞募集、單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化以及巨噬細(xì)胞極化成TAMs的所有步驟[13]。研究發(fā)現(xiàn)TSC2-mTOR途徑調(diào)節(jié)的自噬是單核細(xì)胞分化為T(mén)AM M2表型中的決定因素[14]。目前的研究表明腫瘤細(xì)胞能以分泌自噬小體的方式，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[15-16]。雷帕霉素可抑制EFAD小鼠p-mTOR表達(dá)，增加自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果也證實(shí)了雷帕霉素作為經(jīng)典的mTOR抑制劑，顯示出具有免疫抑制特性。然而，有關(guān)腫瘤自噬水平與腫瘤微環(huán)境中不同免疫表型TAM的關(guān)系，尤其是對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響報(bào)道罕見(jiàn)。

丹參酮ⅡA是從傳統(tǒng)中藥丹參根中提取的菲醌類衍生物,具有廣譜的抗腫瘤活性,對(duì)于大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞系都有效,主要誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯、線粒體依賴的凋亡以及自噬等[18]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其所含的丹參酮ⅡA可抑制肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤生長(zhǎng)[19]。丹參酮ⅡA可以激活大量M2型巨噬細(xì)胞，以減弱M1型巨噬細(xì)胞極化引起的炎癥反應(yīng)，增加抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有效發(fā)揮修復(fù)和重塑受損組織的作用；還可以通過(guò)miR-375/KLF4途徑協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞自噬和M2極化的相互作用[20]。本研究觀察不同濃度的丹參酮ⅡA對(duì)與TAM M2共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞進(jìn)行處理后LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)量，推測(cè)丹參酮ⅡA可能主要是通過(guò)抑制EMT信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用，且隨著丹參酮ⅡA的濃度增加，共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力降低，也表明了丹參酮的抗腫瘤活性。雷帕霉素作為經(jīng)典的mTOR抑制劑，用于改變TAMs的自噬狀態(tài)，直接影響TAMs的生物學(xué)行為，并能夠間接改變腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TAMs、自噬、EMT相互之間存在非常復(fù)雜的關(guān)系，本研究表明雷帕霉素可以誘導(dǎo)TAMs自噬，丹參酮ⅡA能夠影響TAMs自噬共培養(yǎng)的A375細(xì)胞的EMT改變，并具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，可以推測(cè)，丹參有效單體成分在抗腫瘤方面存在較大的研究?jī)r(jià)值及開(kāi)發(fā)潛力，為抗腫瘤臨床藥物的研發(fā)提供了參考，但還需要在基因轉(zhuǎn)染、在體實(shí)驗(yàn)等方面進(jìn)一步深入了解他們相互之間的作用機(jī)制。