鄭文月, 馬季, 臧海英, 馮清藍(lán), 王維佳, 米次仁, 鄧成成,朱定衡

1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

瘢痕疙瘩是成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原過(guò)度累積的病理性瘢痕組織，存在與腫瘤相似的表觀遺傳學(xué)改變[1-3]。單一治療手段難以達(dá)到理想的控制效果，手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放療被證實(shí)能有效預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)[4]。目前臨床報(bào)道手術(shù)聯(lián)合早期淺層X(jué)射線放療對(duì)控制瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)更為有效[5]。據(jù)報(bào)道，瘢痕疙瘩放療在5 Gy劑量組療效較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]，且復(fù)發(fā)率與總劑量相關(guān)[7]，而關(guān)于放療的最適間隔周期尚無(wú)定論。本研究旨在探討不同間隔周期淺層X(jué)射線照射人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(human keloid fibroblasts，HKF)后，HKF及細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)本來(lái)源于2021年1月至2021年12月南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院行手術(shù)切除的瘢痕疙瘩標(biāo)本6例，其中穩(wěn)定期2例，進(jìn)展期4例。所有瘢痕疙瘩患者均局部無(wú)感染潰瘍，未接受過(guò)任何藥物及放射治療。經(jīng)臨床及病理確診后，所有標(biāo)本取材均已獲得患者本人或監(jiān)護(hù)人的知情同意。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Scientific)，胎牛血清(FBS，以色列Biological Industries)，Trizol和PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)，上下游引物(上海生工生物工程有限公司)，SYBR Green Premix qPCR Kit(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，兔抗人Collagen Ⅰ抗體(美國(guó)CST)，兔抗人Collagen Ⅲ抗體(美國(guó)Abcam)，Human Collagen Ⅰ ELISA Kit(南京建成生物工程研究所有限公司)，SRT-100 VisionTM淺層放射治療系統(tǒng)(美國(guó)Sensus Health)。

1.3 方法

1.3.1 HKF的分離培養(yǎng) 于南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院手術(shù)室無(wú)菌條件下收集人瘢痕疙瘩組織用于提取和培養(yǎng)原代HKF。于超凈細(xì)胞臺(tái)用含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液多次沖洗瘢痕組織，用剪刀盡量剪去真皮下脂肪組織，將每塊組織剪至約0.1 cm×0.1 cm大小的矩形，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱中，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，并進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)中使用傳至第3代的成纖維細(xì)胞。

1.3.2 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射HKF 取4×105/孔處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HKF接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。根據(jù)照射間隔時(shí)間不同，分別設(shè)間隔1、2、3、4、5、6、7 d 7個(gè)組，設(shè)置無(wú)照射空白對(duì)照組(0 d)，共8組。實(shí)驗(yàn)中需照射細(xì)胞均采用S-100淺層X(jué)射線放射治療系統(tǒng)，1～7組分別間隔1～7 d進(jìn)行照射，所有組單次照射劑量均為5 Gy，2.6 min，共照射3次;空白對(duì)照組不照射。

1.3.3 Western blot檢測(cè)各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) 第22天(從實(shí)驗(yàn)組第1次照射起算)，收集8組HKF，裂解破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。制備好的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入稀釋的一抗，Ⅰ 型膠原蛋白(1∶1 000)，Ⅲ型膠原蛋白(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。顯影，拍照定影，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)水平 利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由中國(guó)生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA檢測(cè)各組HKF培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá) 收集HKF培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的分泌水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后在酶標(biāo)儀中讀取各孔450 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組HKF培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPadPrism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果至少經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出，對(duì)照組與不同間隔周期淺層X(jué)射線照射組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射對(duì)HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，與未處理組(0 d)相比，各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中 Ⅰ 型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平均明顯降低。其中，間隔3 d組(t=12.09，P<0.01)最低(圖1)；各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中Ⅲ型膠原蛋白亦降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，間隔3 d組Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)出現(xiàn)升高值，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=5.22，P<0.05，圖1)。Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，間隔3 d組下降值最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.67，P<0.01)，而間隔7 d Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射后各組Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平

2.2 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射對(duì)HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平的影響

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白與未處理組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，間隔1 d組出現(xiàn)低峰值(t=9.97，P<0.01,圖2);各實(shí)驗(yàn)組Ⅲ型膠原蛋白水平與未處理組比較，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。與未處理組相比Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在間隔3 d下降值最明顯(P<0.01)，而間隔5 d(t=0.21，P>0.05)和間隔7 d(t=0.66，P>0.05)Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射后各組Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平

2.3 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射對(duì)HKF培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平的影響

不同時(shí)間間隔淺層 X射線照射處理后，與未處理組相比，各實(shí)驗(yàn)組HKF培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白分泌水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。間隔3 d(t=5.95，P<0.01)和6 d組(t=5.53，P<0.001)培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)出現(xiàn)兩個(gè)低峰值，呈一定的時(shí)間依賴性(圖3)。

圖3 不同間隔周期淺層X(jué)射線照射后各組HKF分泌上清中Ⅰ型膠原蛋白水平

3 討論

瘢痕疙瘩是臨床常見(jiàn)的病理性瘢痕，主要組織學(xué)特征為局部成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度堆積[8]。瘢痕疙瘩具有侵襲性生長(zhǎng)、增殖和分化異常等特點(diǎn)，最關(guān)鍵的特點(diǎn)是有類(lèi)似腫瘤的缺氧微環(huán)境[9]，放射療法通過(guò)直接或間接電離作用抑制細(xì)胞分裂和增殖，作為腫瘤的主要治療手段之一，同樣適用于瘢痕疙瘩[10]。目前研究表明，在不同劑量電離輻射作用下，放療后不同階段可通過(guò)激活整合素和生長(zhǎng)因子受體增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的G2/M細(xì)胞周期停止、凋亡或其他生物學(xué)改變[11]。HKF經(jīng)電離輻射后引起DNA損傷誘導(dǎo)衰老表型，參與成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)重塑[12]，且大量研究證據(jù)表明衰老與表觀遺傳密切相關(guān)[13]。然而，放射治療通過(guò)改變細(xì)胞周期或微環(huán)境調(diào)控表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)治療瘢痕疙瘩的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

淺層X(jué)射線聯(lián)合術(shù)后放療可以達(dá)到預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)的目的[14]。Sakamoto等[7]指出瘢痕疙瘩術(shù)后生物學(xué)有效劑量(BED)為20 Gy，分5次治療后復(fù)發(fā)率為11%，認(rèn)為瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)率與BED呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。Flickinger等[15]指出身體其他部位病變電子輻射劑量高于耳垂瘢痕疙瘩，且表明短療程、高分割劑量是防止復(fù)發(fā)的最佳策略。本研究采用一個(gè)特定總劑量(15 Gy)不同時(shí)間間隔(1～7 d)對(duì)HKF進(jìn)行淺層X(jué)射線照射。Ⅰ型膠原是真皮細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)主要成分，當(dāng)皮膚受傷或真皮修復(fù)期間，Ⅲ型膠原蛋白含量會(huì)暫時(shí)增加，延遲上調(diào)TGF-β3以及降低Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)[16]。本研究在不同間隔的各組經(jīng)3次連續(xù)照射后，HKF內(nèi)膠原分泌均較前減少，且間隔前3 d對(duì)細(xì)胞外上清中Ⅰ型膠原蛋白分泌水平均有顯著抑制作用(P<0.01)。而Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在第1～3天隨時(shí)間間隔逐漸增高，第3天達(dá)最高水平(P<0.01)。以上結(jié)果共同提示照射間隔控制在3 d內(nèi)，淺層X(jué)射線對(duì)HKF膠原蛋白的表達(dá)具有顯著影響。近期關(guān)于瘢痕疙瘩術(shù)后放射治療時(shí)機(jī)的Meta分析也總結(jié)了瘢痕疙瘩切除術(shù)后72 h內(nèi)放射治療療效優(yōu)于72 h后放射治療療效的結(jié)論[17]。X射線輻射可通過(guò)控制成纖維細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)早衰老來(lái)防止瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)[18]。另外，細(xì)胞的無(wú)限增殖受關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)G1、G2及S期調(diào)控，間隔放射療法給予了細(xì)胞修復(fù)的時(shí)間，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換[19]。周期蛋白D/CDK4磷酸化Rb使p53激活，可抑制周期蛋白E/CDK2，使周期停止，控制細(xì)胞循環(huán)，抑制細(xì)胞增殖[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示間隔1～3 d淺層X(jué)射線照射后可能存在使細(xì)胞損傷停留在不同階段如G1/S期、G2/M期，或使處于相對(duì)抗拒放射時(shí)相的細(xì)胞向放射敏感時(shí)相移動(dòng)的再分布現(xiàn)象。

瘢痕疙瘩的形成是膠原不斷沉積的結(jié)果，局部微環(huán)境除了可通過(guò)自身DNA序列改變之外，還可通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶及非編碼RNA影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路和膠原蛋白的表達(dá)[21]。一些文獻(xiàn)報(bào)道瘢痕疙瘩皮損及成纖維細(xì)胞p16基因低表達(dá)，輻射能誘導(dǎo)DNA甲基化模式發(fā)生改變和細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明顯升高[22]，但具體通過(guò)特定基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)及何種途徑，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，淺層X(jué)射線可通過(guò)影響HKF膠原蛋白分泌周期抑制膠原產(chǎn)生，結(jié)合Pogribny等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量X射線輻照HKF后出現(xiàn)衰老表型特征，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平降低，推測(cè)淺層X(jué)射線治療瘢痕疙瘩療效可能歸因于對(duì)HKF表觀遺傳學(xué)影響。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果比較淺層X(jué)射線照射后HKFⅠ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值，當(dāng)兩次分割劑量時(shí)間間隔延長(zhǎng)至4～7 d時(shí)，淺層X(jué)射線對(duì)成纖維細(xì)胞的膠原蛋白分泌作用在間隔5 d和間隔7 d出現(xiàn)回升趨勢(shì)，可能由于細(xì)胞分裂或再群體化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生增加。為進(jìn)一步證實(shí)不同時(shí)間間隔淺層X(jué)射線照射后細(xì)胞外膠原蛋白表達(dá)的影響，本研究利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)基上清膠原蛋白含量，結(jié)果表明1～3 d和4～6 d膠原蛋白抑制率逐漸升高，可能存在淺層X(jué)射線照射后膠原蛋白最適抑制周期。瘢痕疙瘩除了通過(guò)COL1A1信號(hào)通路影響HKF的形成和凋亡，還受到缺氧環(huán)境等復(fù)雜微環(huán)境的影響，因此進(jìn)一步探討淺層X(jué)射線照射對(duì)細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白及表觀遺傳學(xué)改變的影響，可能是本課題未來(lái)的研究方向。

綜上所述，本研究證明了淺層X(jué)射線對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌的抑制作用，推測(cè)高張力部位需給予足夠大的輻射劑量，且照射間隔控制在3 d內(nèi)對(duì)預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)具有重要意義，隨著間隔時(shí)間延長(zhǎng)，膠原蛋白分泌出現(xiàn)回升趨勢(shì)，但確切的分子機(jī)制還有待深入研究，最佳放射治療間隔周期還需結(jié)合臨床綜合評(píng)估。