鄧楹君 劉勝京 高慶和 任 凱 郭 軍

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院（北京 100091）

尿路感染（urinary tract infection,UTI）是腎、輸尿管、膀胱和尿道等泌尿系統(tǒng)各個(gè)部位感染的總稱，是最常見(jiàn)的感染性疾病之一，目前已是僅次于呼吸道感染的第二大感染性疾病。大多數(shù)尿路感染由來(lái)源于腸道菌群的兼性厭氧菌感染引起，還可由表皮葡萄球菌和白念珠菌等感染引起，常見(jiàn)的致病菌有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌等，西醫(yī)治療以抗生素治療為主，但易出現(xiàn)耐藥性[1]，細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜，一旦產(chǎn)生增加治療難度，是治療過(guò)程中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。中醫(yī)藥治療尿路感染能有效減輕癥狀，并在降低尿路感染復(fù)發(fā)率方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[2]?？肆芡z囊是經(jīng)典苗方，由頭花蓼和黃柏組成，廣泛應(yīng)用于西醫(yī)尿路感染、慢性前列腺炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石等疾病，前期臨床觀察顯示出克淋通膠囊對(duì)濕熱瘀阻證型的輕中度尿路感染、上尿路結(jié)石術(shù)后的尿路感染均體現(xiàn)出了良好臨床療效[3,4]，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，研究克淋通膠囊藥物成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系和潛在通路，從而預(yù)測(cè)其治療尿路感染的相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)克淋通膠囊的進(jìn)一步研究和尿路感染的治療提供參考。

材料與方法

一、克淋通膠囊藥物活性成分獲取

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索克淋通膠囊化學(xué)成分。其中，TCMSP 檢索條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18。在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中將收集到的化學(xué)成分進(jìn)行確證，并將其化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)化，下載SMILES序列。

二、藥物活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)Swiss 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行作用靶點(diǎn)篩選,篩選規(guī)則為probability≥0.9 的靶點(diǎn)。 以“urinary tract infection”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索疾病的靶點(diǎn)，獲得與尿路感染相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

三、潛在作用靶點(diǎn)的獲取

利用R 軟件，將上述得到的藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)相映射，得到克淋通膠囊治療尿路感染的潛在作用靶點(diǎn)。

四、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)，設(shè)置蛋白種類為“Homosapiens”，combinedscore為0.9，構(gòu)建克淋通膠囊治療尿路感染的PPI（protein interaction）網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用其cytoHubba插件計(jì)算圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的degree 值，以篩選克淋通膠囊治療尿路感染的核心靶點(diǎn)。

五、富集分析

將克淋通膠囊治療尿路感染的靶點(diǎn)利用R軟件進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因、基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。背景數(shù)據(jù)庫(kù)和基因集限定物種為“Homo sapiens”，閾值設(shè)置為P＜0.05，即得到功能富集分析中分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組分以及信號(hào)通路富集分析結(jié)果。

六、可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

根據(jù)上述得到的成分靶點(diǎn)通路，利用Cytoscape構(gòu)建克淋通膠囊治療尿路感染的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

一、克淋通膠囊藥物活性成分的篩選

基于數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)克淋通膠囊藥物成分進(jìn)行篩選最終納入65個(gè)有效成分。

二、藥物活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)Swisstarget 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得藥物的相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后得到481個(gè)與尿路感染相關(guān)度較高的靶點(diǎn)。

三、藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射

利用R 軟件，將上述得到的藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射，得到220個(gè)克淋通膠囊治療尿路感染的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 尿路感染靶點(diǎn)-克淋通膠囊活性成分韋恩圖

四、靶點(diǎn)間相互作用分析

蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）分析顯示：與尿路感染相關(guān)度較高的有AKT1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase1）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase1）、TP53(cellular tumor antigen p53)、TNF（tu-mor necrosis factor）等，是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白。選取最低相互作用閾值大于0.9的數(shù)據(jù)，經(jīng)Cytoscape處理，繪制PPT 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(如圖2A)，并利用R 軟件將出現(xiàn)頻次前20 的靶點(diǎn)繪制條形圖(如圖2B)。

圖2 核心靶點(diǎn)PPI蛋白互作分析

五、基因本體功能富集分析

（一）核心靶點(diǎn)GO富集分析

靶點(diǎn)GO分析得到具有顯著意義的2753個(gè)生物過(guò)程，其中分子功能155 個(gè)，生物過(guò)程2511 個(gè)，細(xì)胞組分87 個(gè)。列出排名前20 的富集結(jié)果如圖3 所示，主要有對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）等過(guò)程。

圖3 核心靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果圖

（二）核心靶點(diǎn)KEGG富集分析

靶點(diǎn)KEGG 富集分析共得到172 條具有顯著意義的通路，選取前20條與尿路感染相關(guān)度較高的通路（如圖4），主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路等。

圖4 KEGG富集分析圖

（三）“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將通路活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，計(jì)算Degree值并繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。

圖5 藥物-成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

苗藥頭花蓼是貴州省特產(chǎn)民族藥和重點(diǎn)培育發(fā)展品種之一，味苦辛，性溫，可解毒、散瘀、利尿通淋，配以黃柏清熱燥濕解毒，兩藥合用清利下焦?jié)駸幔糜跐駸嵯伦?、熱結(jié)膀胱所致的熱淋[5]。中醫(yī)理論認(rèn)為熱淋的產(chǎn)生主要由濕熱致病，《諸病源候論·淋病諸候》中云：“諸淋者，由腎虛而膀胱熱也?！惫视盟幎嘁郧鍩崂麧裢転榉?，克淋通膠囊中藥物雖少，但頭花蓼味苦辛、性溫，苦能清熱解毒，辛能行血散瘀，有利尿通淋之效，黃柏苦寒燥濕，擅清利下焦?jié)駸?，兩藥相合，清而不寒，利濕而不傷陰，共奏通淋之功。現(xiàn)代藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼和黃柏的主要成分對(duì)泌尿系感染常見(jiàn)致病菌具有良好的抑菌效果和抗炎活性，對(duì)多重耐藥性細(xì)菌也有良好的作用[6-8],同時(shí)，頭花蓼利尿通淋的作用能增加單位時(shí)間內(nèi)腎單位的泌尿量，通過(guò)尿液的沖刷作用，減少細(xì)菌的附著和減輕炎癥反應(yīng)[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)可視化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病的干預(yù)方式，符合中藥復(fù)方治療疾病的“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，經(jīng)篩選后得到克淋通膠囊有效成分65 個(gè)，垂釣靶點(diǎn)481個(gè)，疾病靶點(diǎn)2170個(gè)，映射后得到作用于尿路感染的潛在靶點(diǎn)220 個(gè)。體現(xiàn)了克淋通膠囊治療尿路感染具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)?？肆芡z囊中含有的主要成分有山奈酚、槲皮素、槲皮苷、小檗堿等，山奈酚、槲皮素、槲皮苷均屬于黃酮類化合物，廣泛存在于多種中草藥植物中，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示黃酮類化合物具有廣泛的抗細(xì)菌和抗病毒感染的生物活性[10]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性[11]，槲皮素具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗菌作用，可抑制多種炎癥因子的表達(dá)[12]。槲皮苷具有抗氧化能力，并對(duì)致炎因子IL-6、TNF-α和NO具有抑制作用，從而發(fā)揮抗炎效果[13]。小檗堿是生物堿類化合物，對(duì)多種細(xì)菌表達(dá)出不同程度的抗菌活性[14]。與在尿路感染的發(fā)病中，這些黃酮類化合物共同發(fā)揮抗菌作用，抑制病原菌的入侵和粘附、抑制機(jī)體炎癥因子的表達(dá)，從而起到治療尿路感染，減輕下尿路癥狀的作用。

PPI 分析顯示克淋通膠囊治療尿路感染相關(guān)度較高的靶點(diǎn)有AKT1、MAPK1、TP53、TNF等，這些靶點(diǎn)常常出現(xiàn)在全身多種炎癥反應(yīng)之中，在細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用[15,16]。GO 分析結(jié)果顯示克淋通膠囊可能在膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜筏、細(xì)胞基部等位置發(fā)揮結(jié)合泛素樣蛋白連接酶和受體配體活性等分子功能，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過(guò)程起作用。KEGG富集分析顯示主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路，AKT1 是PI3K/AKT 通路上的主要因子[17]，AKT1 缺乏增加炎癥中介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集的趨化因子的表達(dá)，感染期間中性粒細(xì)胞中AKT1 表達(dá)下調(diào)，并與急性炎癥中中性粒細(xì)胞的炎癥活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)[18]。既往實(shí)驗(yàn)研究也印證了克淋通組方的抗炎效果[19]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)克淋通膠囊化學(xué)成分與尿路感染相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，克淋通膠囊可能是通過(guò)抑制細(xì)菌活性和炎癥因子的表達(dá)、恢復(fù)尿路黏膜的屏障作用、抑制病原菌的粘附與侵襲等發(fā)揮多成分多靶點(diǎn)作用治療尿路感染。克淋通膠囊可用于輕中度的泌尿系感染，并在與抗生素聯(lián)用治療復(fù)雜性泌尿系感染方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。