馬曉飛， 黃 寧， 梁鉆好， 杜 冰

（1. 華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642； 2. 陽江職業(yè)技術學院食品與環(huán)境工程系，廣東 陽江 529566）

0 引言

臭鱖魚，徽州名菜，起源于200 多年前，沿江一帶魚販入冬時把新鮮鱖魚（又名桂魚、桂花魚）用木桶裝運至徽州出售，路途需七八天，便以鹽抑腐，經常上下翻動，如此便有一種似臭非臭的特殊氣味，但魚形態(tài)完整，洗凈后經熱油稍煎再細火烹飪，肉質鮮香，醇滑爽嫩。后來如此膾炙人口的佳肴便延續(xù)至今。臭鱖魚以“聞臭吃香”為特色，近幾年隨著鱖魚養(yǎng)殖技術提升而走紅。但臭鱖魚的加工還是以沿用傳統自然發(fā)酵方式的小作坊為主，存在品質和風味不可控、發(fā)酵周期長、高鹽、微生物超標、食用安全性受質疑等現象[1-2]。臭鱖魚的加工技術還沒有一個根本性的革新。

發(fā)酵過程是微生物菌群進行選擇和富集的過程，對臭鱖魚關鍵風味的形成具有決定性作用[3]。大量研究表明，乳酸菌是自然發(fā)酵臭鱖魚的優(yōu)勢菌群，通過分泌蛋白酶作用于魚肌肉蛋白，促進小分子多肽和游離氨基酸的釋放，這些小分子多肽和游離氨基酸不僅是重要的呈味物質，而且也是某些重要特征風味物質的前體物質，在發(fā)酵后期會進一步形成風味物質[4-7]。乳酸菌還能抑制臭鱖魚儲藏后期揮發(fā)性鹽基氮、硫代巴比妥酸值和生物胺的積累[8]。如清酒乳桿菌可明顯降低魚肉甲硫醇等惡臭氣味的產生，同時促進芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和檸檬烯等香氣物質的生成，顯著提升臭鱖魚風味，同時抑制雜菌生長[9-10]。人工添加優(yōu)勢菌干預臭鱖魚發(fā)酵，一方面可定向改善和提升臭鱖魚風味，另一方面可使整個加工環(huán)節(jié)和食品安全具有可控性。

產乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillussp. DU-106）為蠟樣芽孢桿菌屬的一個新亞種，其特點是兼性厭氧，在有氧環(huán)境下也能表現出極強的繁殖能力，高產L-乳酸，經研究具有良好的免疫活性和腸道益生菌特性，應用于中草藥和果蔬發(fā)酵飲料中已表現出極大的優(yōu)勢，關注度不斷提高[11-18]。本課題擬采用產乳酸芽孢桿菌DU-106 復配中國根霉12 發(fā)酵臭鱖魚，利用中國根霉高產脂肪酶催化短鏈脂肪酸合成芳香酯類物質的特點，豐富和柔和臭鱖魚的“臭”味，助力乳酸菌和中國根霉在水產品發(fā)酵中的應用[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮鱖魚、生姜，購于陽江市木賚市場。

產乳酸芽孢桿菌DU-106 凍干粉（活性為3×1010cfu/g）和中國根霉12，均由華南農業(yè)大學新資源食品與功能性原料研究及評價中心提供；葡萄糖粉、可溶性膳食纖維、菊粉、花椒粉、小紅椒粉、茴香粉、白糖和味精，均為食品級。

中國根霉12 活化斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121 °C 滅菌20 min。

中國根霉12 擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 °C 滅菌20 min。

SW-CJ-2F 型超凈工作臺（廣州瑞智凈化設備有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；LAB254e 型電子精密天平（艾德姆衡器（武漢）有限公司）；MAXQ6000型低溫搖床（廣州源起健康科技有限公司）；SPX-250BⅢ型生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及關鍵控制點

工藝流程：新鮮鱖魚→清洗凈膛→接種（添加輔料）→發(fā)酵→清洗→臭鱖魚成品。

關鍵控制點如下。

（1）清洗凈膛。鮮活鱖魚，去魚鰓、魚鱗和內臟，魚酮體用清水沖洗干凈至無血絲，瀝干，稱量，質量約（500 ±100 ）g。

（2）輔料配比?；ń贩?0 g、小紅椒粉20 g、茴香粉5 g、剁碎的生姜10 g、白糖10 g、味精5 g，臨用前混合均勻。

（3）根霉菌液。接種1-2 環(huán)中國根霉12 保藏菌種至PDA 培養(yǎng)基中，32 °C 靜置培養(yǎng)3 d，馬鈴薯液體培養(yǎng)基接種后32 °C 振蕩培養(yǎng)3 d。

（4）乳酸菌粉。6 g 產乳酸芽孢桿菌DU-106 凍干粉、77 g 葡萄糖粉、7 g 可溶性膳食纖維、10 g 菊粉，混合均勻；使用前先用15 mL 無菌生理鹽水30 °C 活化30 min。

（5）發(fā)酵。按一定比例接種根霉菌液和乳酸菌粉，添加鹽和輔料，15 °C 恒溫恒濕箱中發(fā)酵一定時間；期間每天翻一次魚身，3 d 后倒掉多余的浸出液。

（6）清洗。發(fā)酵結束后用無菌水清洗鱖魚酮體，真空包裝，-18 °C 保存。

1.2.2 臭鱖魚加工單因素試驗

加鹽量對臭鱖魚感官評價的影響：分別將0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的食鹽與0.5%輔料、6.0%根霉菌液、3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚酮體表面，至于密封容器中，15 °C 發(fā)酵8 d。

根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評價的影響：分別將0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%的根霉菌液與2.0%食鹽、0.5%輔料、3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚酮體表面，至于密封容器中，15°C 發(fā)酵8 d。

乳酸菌粉添加量對臭鱖魚感官評價的影響：分別將1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的乳酸菌粉與2.0%食鹽、0.5%輔料、6.0%根霉菌液接種量混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚酮體表面，至于密封容器中，15 °C發(fā)酵8 d。

發(fā)酵時間對臭鱖魚感官評價的影響：將2.0%食鹽、0.5%輔料、6.0%根霉菌液和3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚酮體表面，至于密封容器中，15 °C 分別發(fā)酵6、8、10、12、14 d。

1.2.3 臭鱖魚加工工藝優(yōu)化試驗

經單因素試驗，認為根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評價無顯著影響，故以加鹽量、乳酸菌粉添加量和發(fā)酵時間為自變量，感官評分為響應值，采用響應面 Box-Behnken 中心組合設計法對臭鱖魚加工工藝進行優(yōu)化，分析各因素間的交互作用，確定最佳的加工工藝條件。

1.2.4 感官評價

對臭鱖魚的氣味、魚肉組織狀態(tài)和口感進行評價，其中氣味是以生魚作評價，魚肉組織狀態(tài)和口感是以熟魚（清蒸，武火至水沸后轉文火蒸10 min）作評價。

10 分制感官評分細則如表1 所示。選取12 名腌制水產品評價專家進行感官評價，得到的結果去除最高值和最低值后取平均值。

表1 臭鱖魚感官評分細則Tab. 1 Sensory scoring rules of stinky mandarin fish

風味剖面檢驗分析法：對風味（酸味和臭味）、肉質（彈性和蒜瓣狀）、滋味（咸味和酸味）采用6 分定義的標度方法（1-不存在的；2-非常輕微的；3-輕微的；4-明確的；5-顯著的；6-非常顯著的）對臭鱖魚樣品進行強度評價，并進行風味剖面檢驗分析[20]。

1.2.5 數據處理

采用WPS Office 2019 處理數據，并用Origin 8.0 軟件對數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 加鹽量對臭鱖魚感官評分的影響

臭鱖魚腌制過程中，食鹽起到的最主要作用是防腐，其次才是調味和改變肉質口感。如圖1 所示，隨著食鹽的增加，臭鱖魚的氣味略有減弱，蒜瓣狀增強，咸味加重，腐味減弱，總體感官評分先增后減，并在1.0%～2.0%的添加量達到最佳感官評分。腌制期間，食鹽滲透到魚體，魚肌肉細胞脫水，促進形成骨肉分離的蒜瓣肉。食鹽添加量過少，不利于蒜瓣肉的形成；添加量過多，魚肌肉嚴重脫水，魚肉變柴失去彈性，味道太咸，掩蓋了其他滋味，嚴重影響口感，而且鹽分過高也會一定程度上抑制優(yōu)勢菌的繁殖。

圖1 加鹽量對臭鱖魚感官評分的影響Fig. 1 Effect of salt dosage on sensory score of stinky mandarin fish

2.2 根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評分的影響

根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評分的影響如圖2 所示。相比不添加根霉（接種量為0），少量接種根霉后，臭鱖魚感官評分顯著提高。根霉接種量為2.0%～8.0%時，臭鱖魚感官評分徘徊在6.0～7.5 分，屬于中等級別。當接種量增加至10.0%時，臭鱖魚開始出現明顯的惡心腐臭味，感官評分驟然下降至（4.3±0.2）分的不合格等級。即根霉菌液接種量較少（2.0%～6.0%）時，接種量對臭鱖魚感官評分無顯著影響，考慮經濟因素，根霉菌液以2%接種量為宜。

圖2 根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評分的影響Fig. 2 Effect of Rhizopus inoculation amount on sensory score of stinky mandarin fish

單純乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵8 d 后“臭”味仍不明顯，但添加根霉后，臭鱖魚的“臭”味變得顯著，即根霉有助于加速發(fā)酵，一定程度上提升產品風味。但乳酸菌和根霉之間有一個協同發(fā)酵的比例，超出范疇，二者可能會產生拮抗和抑制作用[21]。因此，根霉添加量太大，繁殖速度過快，臭鱖魚的臭味就會變得過重，魚肉出現腐爛。

2.3 乳酸菌粉添加量對臭鱖魚感官評分的影響

乳酸菌粉添加量對臭鱖魚感官評分有顯著影響。如圖3 所示，添加量從1.0%增加至5.0%，臭鱖魚感官評分呈階梯式下降。添加量為1.0%和2.0%時，臭鱖魚具有發(fā)酵后的特殊酸臭味，肉質嫩滑，骨肉分離，蒜瓣狀明顯，口感略帶酸味，感官評分接近優(yōu)良；添加量增加至3.0%和4.0%時，臭鱖魚酸臭味加重，肉質的嫩滑度下降，有蒜瓣狀但不明顯，酸味口感突出，感官評分下降；當添加量5.0%時，臭鱖魚的酸味、酒精味沖鼻，肉質變柴，酸腐味明顯。乳酸菌粉最佳添加量為1.0%～2.0%。

圖3 乳酸菌粉添加量對臭鱖魚感官評分的影響Fig. 3 Effect of addition amount of lactic acid bacteria powder on sensory score of stinky mandarin fish

產乳酸芽孢桿菌DU-106 兼性厭氧，在有氧的環(huán)境下也能高質量繁殖：一方面產生以乙偶姻為代表的具有發(fā)酵奶酪味的揮發(fā)性成分，使臭鱖魚的“臭”味更具層次感；另一方面高產的L-乳酸可賦予臭鱖魚柔和的酸味口感，同時形成抑制雜菌的酸性環(huán)境。然而乳酸菌的過度繁殖及乳酸蓄積過多，魚肉pH 值下降明顯，會導致蛋白質聚集、變性，表現為肌肉持水性下降，保水性變差，魚肉嫩度下降，肉質變柴。

2.4 發(fā)酵時間對臭鱖魚感官評分的影響

發(fā)酵是臭鱖魚特征風味逐漸成熟的過程，因此發(fā)酵時間是影響臭鱖魚感官評分的一個重要指標。發(fā)酵時間不夠，魚肉蛋白質未能充分水解呈多肽和氨基酸，風味前提物質積累不足；發(fā)酵時間過長，微生物繁殖過盛，魚肉又會腐爛變質。如圖4 所示，發(fā)酵時間8～10 d 為宜。

圖4 發(fā)酵時間對臭鱖魚感官評分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory score of stinky mandarin fish

2.5 臭鱖魚加工工藝優(yōu)化

根霉菌液接種量對臭鱖魚感官評價影響不顯著，直接固定根霉菌液接種量為2%，選取加鹽量、乳酸菌粉添加量、發(fā)酵時間3 個因素為自變量，感官評分為響應值，根據Box-Behnken 中心組合設計原理，設計3 因素3 水平、15 個試驗點的響應面分析試驗，因素水平編碼如表2 所示，試驗結果如表3 所示。

表2 因素和水平編碼值Tab. 2 Orthogonal test factors and levels

利用Design-Expert Version 10.0.7 中的響應面設計法（RSM）對表3 試驗數據進行多元回歸擬合，去除不顯著變量，得到自變量與臭鱖魚感官評分（Y）二次多項回歸模型為

表3 響應面設計與試驗結果Tab. 3 Response surface design and experimental results

回歸方差分析顯著性檢驗（表4）表明，該回歸模型P<0.01，回歸方程模型達到極顯著水平，失擬項P=0.070>0.05，不顯著；該回歸模型的總決定系數R2=0.817 0，調整決定系數R2Adj=0.928 3，說明該模型的擬合程度較好，試驗誤差較小，因此該回歸方程模型能較好地對臭鱖魚加工工藝進行分析及預測。影響臭鱖魚感官評分的主次因素順序為發(fā)酵時間>乳酸菌粉添加量>加鹽量。其中發(fā)酵時間（X3）達到極顯著水平（P<0.01），乳酸菌粉添加量（X2）達到顯著水平（P<0.05），加鹽量（X1）影響不顯著（P>0.05）。

表4 回歸方程模型方差分析Tab. 4 Variance analysis of regression equation model

臭鱖魚的最優(yōu)加工條件為加鹽量1.4%、輔料添加量0.5%、根霉菌液接種量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 發(fā)酵8 d。在該條件下，臭鱖魚感官評分的理論值可高達9.49 分。在此條件下進行驗證試驗，得到的臭鱖魚氣味帶酸帶臭，氣味濃郁但不刺鼻，肉質嫩滑，呈骨肉分離的蒜瓣狀，口感咸味適中，微酸，肉質鮮美無明顯腐味?？傮w感官評分為（9.40± 0.42）分，與理論預測值的相對誤差僅為0.95%。

2.6 臭鱖魚風味剖面分析

采用風味剖面檢驗分析法對接種發(fā)酵臭鱖魚和對照組自然發(fā)酵臭鱖魚（加鹽量1.4%、輔料添加量0.5%、15 °C 發(fā)酵8 d）的風味、滋味、口感進行6 點評分，結果如圖5 所示。兩種方式得到的臭鱖魚風味差異較大，對照組腐、臭、腥味顯著，而且尖銳刺鼻；接種發(fā)酵組臭味雖濃郁，但相對柔和，帶有酸味、臭味、香味，細聞具有明顯的層次感。滋味方面也有明顯區(qū)別，接種發(fā)酵組比對照組增加了酸味，產乳酸芽孢桿菌DU-106 繁殖產乳酸，以及微生物代謝酶對魚肉蛋白的水解作用，促進了呈味氨基酸的釋放，酸味、甜味、鮮味、苦味的增加會削弱咸味和腥味，因此二者的咸味表現感與加鹽量并不完全一致[22]。接種發(fā)酵組的蒜瓣狀形成效果也明顯優(yōu)于對照組，這表明接種中國根霉12 和產乳酸芽孢桿菌DU-106 能有效促進魚肉形成蒜瓣狀肉質。

圖5 臭鱖魚風味剖面檢驗分析結果Fig. 5 Results of flavor profile inspection and analysis of stinky mandarin fish

3 結論

接種中國根霉12 和產乳酸芽孢桿菌DU-106 混合發(fā)酵制備臭鱖魚，可定向改善臭鱖魚風味。在單因素試驗的基礎上進行響應面優(yōu)化，得出最優(yōu)加工工藝條件為加鹽量1.4%、根霉菌液接種量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 發(fā)酵8 d。此條件下得到的臭鱖魚感官評分為9.4，屬于優(yōu)良級別。相比臭味刺鼻的自然發(fā)酵臭鱖魚，接種發(fā)酵的臭鱖魚風味和滋味上增加了酸味，更有利于蒜瓣狀肉質的形成，酸臭味豐富濃郁而柔和、富有層次感。中國根霉12 和產乳酸芽孢桿菌DU-106可應用于臭鱖魚發(fā)酵。