王雅歆，顏 菲，李建龍

（1. 南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210093；2. 南京市長樂農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，江蘇 南京 211200）

水蜜桃（Prunus persicaL.）是薔薇科桃屬植物，原產(chǎn)于中國并廣泛種植于國內(nèi)各省。其果實(shí)滋味甘甜，且富含多種糖類、維生素C 等營養(yǎng)成分，有清胃、潤肺等功效。水蜜桃上市時正值夏季，氣候適宜微生物生長和繁殖，故水蜜桃采摘后極易因致病真菌感染而腐爛變質(zhì)，貨架期縮短，影響銷售，并由此引發(fā)了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，水蜜桃采摘后的保鮮方法對于延長水蜜桃果實(shí)貯藏時間舉足輕重。

目前，國內(nèi)對水蜜桃保鮮的措施以低溫或氣調(diào)貯藏等各項(xiàng)物理方法以及化學(xué)保鮮法為主[2?3]。其中，低溫貯藏仍是目前應(yīng)用最為廣泛的保鮮方法，低溫狀態(tài)下桃果實(shí)的呼吸被顯著抑制，各類酶活性和細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率也顯著降低。氣調(diào)貯藏則是應(yīng)用環(huán)境中二氧化碳和氧氣調(diào)控果實(shí)呼吸作用并延長貯藏期的方法，該技術(shù)效果好，且相較于冷藏，降低了果實(shí)凍傷的風(fēng)險[4]。化學(xué)殺菌劑能有效干預(yù)病原菌細(xì)胞的生長和代謝，如擾亂有絲分裂時微管蛋白的組裝等，進(jìn)而減少果實(shí)采后損失[5]。但目前應(yīng)用的技術(shù)中，物理保鮮能源消耗較大，化學(xué)保鮮無法保證絕對安全。因此，尋找新的保鮮技術(shù)十分重要。生物保鮮技術(shù)是指利用動植物或微生物來源的小分子、酶類或生物體本身進(jìn)行保鮮的方法[6]。該方法選用的材料具有抑制果蔬中致病菌類或其次級代謝產(chǎn)物的效用，且大多對人體有益。該技術(shù)安全性更高、能耗更低，但在國內(nèi)應(yīng)用較少。

拮抗酵母菌保鮮技術(shù)是一種新興的生物防治方法，可通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，包括競爭營養(yǎng)和空間、寄生、誘導(dǎo)宿主抗性、產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)化合物等[7]。對碳源、氮源和鐵離子等營養(yǎng)和空間的競爭是拮抗酵母菌發(fā)揮效用的主要模式[8]。寄生是指拮抗酵母菌附著并食用病原真菌菌絲，分泌水解酶破壞或溶解真菌結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。拮抗酵母菌還可增強(qiáng)宿主防御相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)防御相關(guān)酶的活性[9]。此外，一些拮抗酵母菌可以產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物，它們的混合物在密閉條件下可控制采后病原體的菌絲生長和產(chǎn)孢作用[10]。拮抗酵母菌保鮮技術(shù)具有無毒無害、無特殊氣味的優(yōu)點(diǎn)，在食品工業(yè)中有著悠久的應(yīng)用歷史[11?12]。王晨等[13]從桃果實(shí)表皮分離得到1株對桃褐腐病菌抑制率較好的葡萄汁有孢漢遜酵母，活體抑菌率可達(dá)50.30%。張俊杰等[14]從葡萄果實(shí)表面分離出1株對黃瓜枯萎病病菌抑菌率達(dá)到52%的葡萄汁有孢漢遜酵母。張曉云等[15]建立了基于膜醭畢赤酵母的噴霧干燥固體制劑制備技術(shù)，可加速酵母在桃果實(shí)采后病害防治中的應(yīng)用進(jìn)程。幾種拮抗酵母菌混合使用是提高保鮮效果的途徑之一，SHARMA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉和異常畢赤酵母混合使用可以有效控制芒果炭疽病。目前，拮抗酵母菌組合處理方法在水蜜桃保鮮領(lǐng)域鮮有報道。鑒于此，選取羅倫隱球酵母懸浮液、喜橄欖假絲酵母懸浮液及間型假絲酵母懸浮液對鳳凰水蜜桃進(jìn)行組合處理，研究其對鳳凰水蜜桃采后貯藏品質(zhì)的影響，旨在為水蜜桃常溫貯藏保鮮提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

水蜜桃：于2021 年8 月采摘自張家港市鳳凰鎮(zhèn)，所選桃子約八成熟，色澤相近，發(fā)育正常，果實(shí)質(zhì)量均勻，外形一致，無病蟲害和機(jī)械損傷。

拮抗酵母菌：羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）、喜橄欖假絲酵母（Candida oleophila）、間型假絲酵母（Candida intermedia）均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

XB-K-25 血球計數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型無菌操作臺：蘇凈安康空氣技術(shù)有限公司；BIO2 光學(xué)顯微鏡：伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；THZ-C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；BS124S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HS-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：貴陽科學(xué)儀器研究所；756MC 紫外-可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；TGL1650-WS臺式高速離心機(jī)：上海盧湘儀器有限公司；GY-3 型硬度儀：浙江托普儀器有限公司；VBR-18 型手持式折光儀：泉州市萬達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗酵母菌的活化 分別向羅倫隱球酵母、喜橄欖假絲酵母和間型假絲酵母凍干粉中加入少量無菌水混勻，取少許涂布于PDA 固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至獲得單菌落。挑一單菌落于100 mL YPD 培養(yǎng)基（水100 mL、酵母膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g）中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r/min，28 ℃）中培養(yǎng)48 h。用無菌水稀釋得到5×108cfu/mL 喜橄欖假絲酵母懸浮液（P1）、1×108cfu/mL 間型假絲酵母懸浮液（P2）、5×108cfu/mL 羅倫隱球酵母+5×108cfu/mL喜橄欖假絲酵母懸浮液（P3）、5×108cfu/mL 羅倫隱球酵母+1×108cfu/mL 間型假絲酵母懸浮液（P4）以及5×108cfu/mL 羅倫隱球酵母+5×108cfu/mL 喜橄欖假絲酵母+1×108cfu/mL 間型假絲酵母懸浮液（P5）[17]。通過預(yù)試驗(yàn)篩選喜橄欖假絲酵母菌懸浮液及間型假絲酵母菌懸浮液的群落總數(shù)。

1.3.2 試驗(yàn)分組及處理 取成熟度約八成且一致、外形色澤接近、外表無機(jī)械損傷和霉變的水蜜桃果實(shí)，隨機(jī)分為6 組，設(shè)置5 個處理組：喜橄欖假絲酵母組（P1）、間型假絲酵母組（P2）、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組（P3）、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組（P4）、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組（P5）；設(shè)置1 個對照組（CK）；每組8 個果實(shí)。分別置于各菌懸液中浸泡2 min，取出后放置晾干，對照組不做處理，置于常溫（25～30 ℃）環(huán)境下，每日測定并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。由于取樣時僅取水蜜桃的一小部分，故單個水蜜桃可測全部的8個指標(biāo)。試驗(yàn)期8 d。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1 腐爛等級 將果面的腐爛程度劃分為5個等級。0 級為果實(shí)完好；按果面腐爛面積分為1～4 級，1 級：極?。? 個以下斑點(diǎn)）；2 級：不超過1/2；3 級：1/2～3/4；4級：大于3/4[18]。

1.4.2 失重率 處理前果實(shí)的質(zhì)量記為W0，每次測定時果實(shí)的質(zhì)量記為W，計算失重率：失重率=（W0-W）/W0×100%。

1.4.3 硬度 采用GY-3 型硬度儀測定硬度[19]。在果實(shí)中間最大橫徑處削去果皮，測定3 次，取平均值。硬度儀的最小量程為4.75 N。

1.4.4 呼吸強(qiáng)度 采用靜置法測定呼吸強(qiáng)度[19]。

1.4.5 可溶性固形物含量 采用VBR-18型手持折光儀測定可溶性固形物含量[19]。

1.4.6 相對電導(dǎo)率 采用DDS-11A 型電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，計算相對電導(dǎo)率：相對電導(dǎo)率=（活組織浸出液電導(dǎo)率/失活組織浸出液電導(dǎo)率）×100%[19]。

1.4.7 丙二醛含量 采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量。利用三氯乙酸提取果實(shí)中的丙二醛，后加硫代巴比妥酸煮沸測定吸光度[19]。

1.4.8 可溶性蛋白含量 采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量[20]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算和差異顯著性分析，利用Origin 2018軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃腐爛等級的影響

從圖1 可以看出，8 d 時，對照組果實(shí)腐爛等級最高，羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組腐爛等級均顯著低于對照組（P<0.05）。

圖1 不同處理對水蜜桃果實(shí)腐爛等級的影響Fig.1 Effects of different treatments on the decay grade of peach fruit

2.2 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃失重率的影響

從圖2 可以看出，水蜜桃果實(shí)的失重率在采后呈現(xiàn)上升趨勢，對照組果實(shí)失重率在貯藏期內(nèi)均高于各處理組。貯藏8 d 時，對照組失重率上升到23.14%，喜橄欖假絲酵母組、間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組分別為15.75%、19.40%、18.45%、16.09%和17.69%。與對照組相比，各處理組果實(shí)失重率均顯著降低（P<0.05），其中喜橄欖假絲酵母組最低，下降7.39個百分點(diǎn)。

圖2 不同處理對水蜜桃果實(shí)失重率的影響Fig.2 Effects of different treatments on weight loss rate of peach fruit

2.3 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃硬度的影響

從圖3 可以看出，水蜜桃果實(shí)硬度在采后呈下降趨勢，貯藏2 d 時下降速度最快；貯藏5 d 時，與貯藏0 d時相比，對照組果實(shí)硬度下降86.72%，喜橄欖假絲酵母組、間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組分 別 下 降85.83%、84.52%、85.83%、83.17% 和84.94%，其中羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組顯著低于對照組（P<0.05）。

圖3 不同處理對水蜜桃果實(shí)硬度的影響Fig.3 Effects of different treatments on fruit hardness of peach fruit

2.4 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃呼吸強(qiáng)度的影響

從圖4 可以看出，果實(shí)在采后3 d 時出現(xiàn)第1 次呼吸峰，7 d 時達(dá)到第2 次呼吸峰，對照組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度峰值明顯高于處理組，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組的呼吸強(qiáng)度峰值最低。貯藏8 d 時，對照組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度為13.75 mg/（kg·h），喜橄欖假絲酵母組、間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組分別為7.24、5.13、7.58、4.35、6.01 mg/（kg·h）。各處理組果實(shí)呼吸強(qiáng)度均顯著低于對照組（P<0.05），說明它們均能有效降低果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，延緩果實(shí)衰老。其中羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組對果實(shí)呼吸的抑制作用最強(qiáng)，與對照組相比，顯著下降68.36%。

圖4 不同處理對水蜜桃果實(shí)呼吸強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different treatments on respiration intensity of peach fruit

2.5 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃可溶性固形物含量的影響

從圖5 可以看出，果實(shí)中可溶性固形物含量在采后呈先上升后下降的趨勢。貯藏7 d 時，對照組的可溶性固形物含量驟降；貯藏8 d 時，與貯藏0 d時相比，對照組果實(shí)的可溶性固形物含量上升14.0%，喜橄欖假絲酵母組、間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組、羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組分別上升17.0%、27.3%、12.5%、14.8%、15.6%。經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，貯藏8 d 時，各處理組之間及與對照組相比均無顯著性差異。

圖5 不同處理對水蜜桃果實(shí)可溶性固形物含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on soluble solids content of peach fruit

2.6 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃相對電導(dǎo)率的影響

從圖6 可以看出，果實(shí)采后相對電導(dǎo)率呈緩慢上升趨勢，各處理組果實(shí)始終低于對照組。貯藏8 d 時，對照組果實(shí)相對電導(dǎo)率達(dá)到84.8%，顯著高于各處理組（P<0.05），單種拮抗酵母菌與復(fù)合處理之間無顯著差異。

圖6 不同處理對水蜜桃果實(shí)相對電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effects of different treatments on relative conductivity of peach fruit

2.7 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃丙二醛含量的影響

從圖7 可以看出，果實(shí)采后丙二醛含量呈上升趨勢，處理組果實(shí)丙二醛含量始終低于對照組。貯藏8 d 時，對照組果實(shí)丙二醛含量達(dá)到2.356 μmol/L，顯著高于各處理組（P<0.05）；貯藏8 d時，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組果實(shí)丙二醛含量分別上升至1.692、1.855 μmol/L，與對照組相比，分別顯著下降28.28%、21.26%。說明羅倫隱球酵母+間型假絲酵母混合菌懸浮液和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母混合菌懸浮液能夠有效抑制水蜜桃果實(shí)的膜脂過氧化，有效保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。

圖7 不同處理對水蜜桃果實(shí)丙二醛含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on MDA content of peach fruit

2.8 3種拮抗酵母菌組合處理對水蜜桃可溶性蛋白含量的影響

從圖8 可以看出，果實(shí)采后可溶性蛋白含量呈緩慢下降趨勢，整個貯藏期內(nèi)，處理組果實(shí)可溶性蛋白含量始終高于對照組。貯藏8 d 時，對照組果實(shí)的可溶性蛋白含量降至0.276 7 mg/g；與對照組相比，間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母+間型假絲酵母組分別顯著上升36.14%、40.95%和37.33%。

圖8 不同處理對水蜜桃果實(shí)可溶性蛋白含量的影響Fig.8 Effects of different treatments on soluble protein content of peach fruit

3 結(jié)論與討論

果實(shí)的各項(xiàng)理化指數(shù)，如失重率、硬度、呼吸強(qiáng)度、可溶性固形物含量、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量及可溶性蛋白含量等均可反映果實(shí)采后品質(zhì)。果實(shí)采后失重主要由呼吸作用帶來的水分蒸發(fā)引起。水蜜桃果皮較薄，水分流失速度較快，果皮皺縮、色澤變暗、口感變差往往發(fā)生于短時間內(nèi)?？刂剖е厥枪繁ｕr的第一步[21]。本試驗(yàn)中，單個拮抗酵母菌及各混合菌懸浮液均能夠在常溫下有效控制果實(shí)失重，這可能源于拮抗酵母菌對果實(shí)呼吸作用的抑制。這與MENG等[22]利用羅倫隱球酵母和殼聚糖涂層復(fù)合處理采后葡萄的研究結(jié)果一致。

果實(shí)采后硬度降低源于果實(shí)細(xì)胞壁水解酶的活性增強(qiáng)[23]。硬度降低后，果實(shí)遇到機(jī)械沖擊或壓縮會產(chǎn)生瘀傷，進(jìn)而霉變、腐爛[24]。本試驗(yàn)中，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組硬度保持最佳，這可能與2 種酵母菌對果實(shí)細(xì)胞壁水解酶活性的抑制相關(guān)。OU 等[25]以UV-C 和熱帶假絲酵母復(fù)合處理菠蘿的研究也有相似結(jié)果。

水蜜桃是典型的呼吸躍變型水果，通常會出現(xiàn)2個呼吸峰，水蜜桃采后呼吸作用明顯加強(qiáng)，不斷消耗儲存的有機(jī)物質(zhì)[26]。本試驗(yàn)中，單個拮抗酵母菌及混合菌懸浮液均能顯著降低采后水蜜桃果實(shí)的呼吸強(qiáng)度。LI等[27]利用大黃提取物和海藻酸鈉涂層處理水蜜桃的研究中也有類似結(jié)果。

可溶性固形物是果實(shí)組織中所有溶解于水的化合物的總稱，可溶性糖是其中的主要成分[28]。由于后熟過程，采后可溶性固形物會稍有積累；同時果實(shí)持續(xù)的呼吸作用也在不斷消耗這些可溶性的營養(yǎng)成分[29]。本試驗(yàn)中，拮抗酵母菌處理顯著延緩可溶性固形物含量的降低，與WIJESINGHE 等[30]采用棘孢木霉處理菠蘿的研究結(jié)果一致。

果實(shí)霉變會引發(fā)細(xì)胞膜的受損，致使其透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的各類電解質(zhì)向外擴(kuò)散，果實(shí)組織浸提液的電導(dǎo)率增大[31]。相對電導(dǎo)率是判斷細(xì)胞膜完整性的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，相對電導(dǎo)率增大可能意味著酶和底物的分離[32]。本試驗(yàn)中，單個拮抗酵母菌及混合菌懸浮液均可顯著降低相對電導(dǎo)率。ZHAO 等[32]以熱空氣和季也蒙畢赤酵母聯(lián)合處理水蜜桃時也有相同結(jié)果。

丙二醛是植物細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物。丙二醛含量越高，膜脂過氧化程度越大，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷程度越大[33]。本試驗(yàn)中，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組+間型假絲酵母組果實(shí)丙二醛含量均顯著降低，這可能與拮抗酵母菌對膜脂過氧化的抑制作用相關(guān)。FENG 等[34]利用3 種拮抗酵母菌處理扁豆的研究也得到了相同結(jié)果。

可溶性蛋白能以小分子狀態(tài)溶于水，更易于人體吸收，是重要的營養(yǎng)成分之一，同時它們能起到滲透調(diào)節(jié)作用，對生物膜及其中的物質(zhì)起到保護(hù)作用?？扇苄缘鞍缀靠勺鳛榉从乘厶业酿B(yǎng)分含量和部分抗性的主要指標(biāo)之一[35]。本試驗(yàn)中，間型假絲酵母組、羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組和羅倫隱球酵母+喜橄欖假絲酵母組+間型假絲酵母組果實(shí)可溶性蛋白含量均顯著上升。這可能源于拮抗酵母菌對果實(shí)中防御相關(guān)酶基因的激活。WU等[36]在利用枯草芽孢桿菌和熱處理聯(lián)合作用桃的研究中也有類似結(jié)果。

水蜜桃果實(shí)在貯藏期極易感染霉菌，致使果實(shí)腐爛變質(zhì)。一旦霉變發(fā)生，由于微生物繁殖極快，單個果實(shí)的病變面積會迅速擴(kuò)大，甚至感染未發(fā)生霉變的果實(shí)[37]。本試驗(yàn)采用拮抗酵母菌組合處理方法，其綜合保鮮效果優(yōu)于單一拮抗酵母菌懸液處理，這可能是因?yàn)閱蝹€拮抗酵母菌對不同致病真菌的抑菌強(qiáng)度不同，多種拮抗酵母菌組合后能更好地覆蓋抗菌譜，從而達(dá)到廣譜抗菌效果。整體上，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母菌懸液處理后的水蜜桃各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)較好，說明這一處理抑制水蜜桃致病真菌生長的效果最佳。將來，利用日益成熟的組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)以及工程策略，可以開發(fā)穩(wěn)定高效的保鮮劑，或是以酵母菌干粉的形式開發(fā)保鮮紙[15]。綜上，羅倫隱球酵母+間型假絲酵母混合菌懸浮液處理是一種經(jīng)濟(jì)有效的水蜜桃保鮮方法，有一定的應(yīng)用前景，可為將來水蜜桃保鮮劑的商品開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。