劉 芹，特日根，師子文，吳 杰，胡素娟，崔 筱，孔維麗

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古農(nóng)牧漁業(yè)生物實驗研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）又名香菌、香蕈、香菰、冬菇、香信等，是我國傳統(tǒng)種植的食用菌品種，深受消費者的喜愛[1]。香菇香氣濃郁，滑嫩鮮美，具有豐富的營養(yǎng)價值和特殊的醫(yī)療保健價值，長期食用能起到防病健身的作用[2?4]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2020 年我國香菇年產(chǎn)量高達1 188.21 萬t，比2019年增加72.26 萬t，增長6.48%[5]。河南省香菇種植面積和年產(chǎn)量均居全國第一，以豫西伏牛山區(qū)為主，香菇產(chǎn)業(yè)已成為河南省助力鄉(xiāng)村振興的主要抓手[6]。游離氨基酸是一類非蛋白質(zhì)氨基酸，占氨基酸總量的25%～35%，是食物味覺活性的重要組成部分[7]。游離氨基酸根據(jù)其呈味特征可分為4個類別：甜味、鮮味、苦味和芳香族氨基酸。甜味氨基酸包括丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和組氨酸（His）；鮮味氨基酸包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和賴氨酸（Lys）；苦味氨基酸包括精氨酸（Arg）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和色氨酸（Trp）；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）[8]。游離氨基酸是香菇中重要的味覺活性物質(zhì)，尤其是Asp 和Glu，是香菇鮮味的主要來源[3]。目前，香菇研究主要集中在采后生理變化、活性物質(zhì)的分離純化及活性評價、保鮮技術(shù)等方面，關(guān)于氨基酸的分析主要是組成和含量測定及方法學(xué)研究，而關(guān)于香菇不同品種間的氨基酸差異性分析鮮見報道[9]。

主成分分析（PCA）是一種通過數(shù)據(jù)降維技術(shù)把多個變量化為少數(shù)幾個主成分的多元統(tǒng)計方法[7，10?16]。目前此方法已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品綜合品質(zhì)評價和特征性評價指標(biāo)的篩選。LI 等[17]利用PCA 對不同培養(yǎng)基栽培的香菇品質(zhì)進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)C/N 高的培養(yǎng)基獲得的香菇口感較好，且該評價方法和傳統(tǒng)感覺評價結(jié)果一致。SUN 等[18]采用PCA發(fā)現(xiàn)野生食用菌特征性游離氨基酸的含量高低與食用菌特征風(fēng)味的形成直接相關(guān)。王馨雨等[19]通過PCA實現(xiàn)對不同品種百合及其內(nèi)外鱗莖中游離氨基酸的綜合評價，可為百合分級加工和品種選育提供參考。本研究擬對河南省常規(guī)栽培的14個香菇品種的游離氨基酸組成及含量進行檢測分析，并比較呈味氨基酸的味道強度值（TAV），采用PCA 法和聚類分析法進行綜合評價，旨在為香菇品種選育和產(chǎn)品的開發(fā)、營養(yǎng)價值與特征風(fēng)味的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試香菇品種農(nóng)香1 號、農(nóng)香3 號、香28、香9608、香1024、香808、香931、香LS、L18、雨花3 號、韓香1 號、南山1 號、香25、豫香1 號均保藏于河南省食用菌種質(zhì)資源庫。栽培試驗于2021 年2—10月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地進行。待香菇子實體長至八成熟時采收，采收后的子實體樣品用保鮮袋分裝，再放入加有冰塊的泡沫箱，運回實驗室后統(tǒng)一采用冷凍干燥機干燥至恒定質(zhì)量。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、茚三酮購自美國Sigma 公司；鹽酸、磺基水楊酸（分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

VFD-2000A 冷凍干燥機（上海比朗儀器設(shè)備制造有限公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）、KQ-數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、L-8900氨基酸自動分析儀（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

參考LIU 等[3]的方法，稱取1.0 g 香菇凍干粉加入10 mL 的100 mmol/L 鹽酸中，在25 ℃超聲提取30 min。5 000×g離心10 min后，取5.0 mL 上清液與5 mL 5.0%磺基水楊酸混合，25 ℃黑暗靜置30 min。5 000×g離心10 min，收集上清液并采用微孔過濾膜（0.22 μm）過濾。采用氨基酸自動分析儀（L8900，Hitachi，日本）對濾液進行測定和分析。采樣前對氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進行分析，通過比對樣品的氨基酸峰譜和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸譜，對樣品中的氨基酸進行鑒定和定量。結(jié)果用每克干質(zhì)量所含氨基酸的毫克數(shù)（mg/g）表示。每份樣品重復(fù)檢測3 次，測定結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析，計算平均值并繪制雷達圖。采用R 語言進行熱圖和PCA 圖繪制。采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），差異顯著性分析采用Duncan’s multiple range tests，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.4.2 TAV 分析 TAV 是樣品中呈味物質(zhì)測定值與其味覺閾值的比值[20]。若TAV>1，則認為該物質(zhì)對呈味有貢獻；若TAV<1，則認為該物質(zhì)對呈味貢獻較小。由此確定香菇中的重要呈味氨基酸[7]。

1.4.3 適應(yīng)性檢驗 采用IBM SPSS Statistics 23.0進行相關(guān)系數(shù)分析，相關(guān)系數(shù)的大小可直接反映原始變量之間線性相關(guān)程度[20]。

1.4.4 PCA 分析及綜合評價 采用IBM SPSS Statistics 23.0 軟件進行PCA 分析，比較不同香菇品種中游離氨基酸的差異，得到原始數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣的特征值、方差貢獻率、成分矩陣及成分得分系數(shù)矩陣等，抽取特征值大于1.00 的因子作為主成分。利用主成分信息對香菇進行綜合評價，以每個主成分所對應(yīng)特征值的方差貢獻率β（ii=1，2，3，…，k）為權(quán)重，由各主成分得分Fi與對應(yīng)的權(quán)重相乘得綜合評價模型：F=β1F1+β2F2+…+βkFk[7，19]。

1.4.5 聚類分析 根據(jù)14 個香菇樣品中游離氨基酸組成及含量測定結(jié)果，采用IBM SPSS Statistics 23.0進行聚類分析，聚類方法為Ward最小方差和歐氏距離法，用樹形圖表示不同香菇品種品質(zhì)的親疏程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸含量與組成的差異

香28、香1024、香808、L18、韓香1號、南山1號、香25 和豫香1 號8 個品種均含有17 種游離氨基酸；其余6 個品種未檢測到Trp，均含有16 種游離氨基酸。14 個香菇品種所檢測到的游離氨基酸組成和含量如圖1所示，中部填充顏色從藍至紅，表示氨基酸含量由低至高。Glu 和Asp 含量均明顯高于其他氨基酸，這一結(jié)果與前期研究結(jié)果類似[3]，Trp 含量最低或沒有檢測到。從總游離氨基酸含量（TFAA）來看（圖2），14 個香菇品種游離氨基酸總含量變化范圍為10.91～20.57 mg/g，結(jié)果與LI等[17]的研究結(jié)果接近，其測定的香菇氨基酸含量在14.24～21.63 mg/g。其中，豫香1 號（20.57 mg/g）游離氨基酸總量最高，香1024（17.92 mg/g）、南山1 號（17.90 mg/g）和農(nóng)香1號（17.61 mg/g）次之，農(nóng)香3 號（10.91 mg/g）含量最低。由此可見，14個香菇品種中游離氨基酸的差異主要體現(xiàn)在含量而非種類上。

圖1 不同品種香菇游離氨基酸比較Fig.1 Comparison of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）提出的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值必需氨基酸模式為：理想蛋白質(zhì)中必需氨基酸/（必需氨基酸+非必需氨基酸）[EAA/（EAA+NEAA）]值應(yīng)達到40%左右；且必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）值應(yīng)在60%以上[21]。從圖2 可以看出，14 個香菇品種EAA/（EAA+NEAA）值為30.87%～39.61%，EAA/NEAA 值為44.65%～65.61%，均接近或超過FAO/WHO 所推薦的理想蛋白質(zhì)指標(biāo)，尤其是豫香1 號游離氨基酸組成和含量最為符合。

圖2 不同品種香菇游離氨基酸的組成及含量Fig.2 Composition and content of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

2.2 游離氨基酸呈味特征和TAV差異

游離氨基酸是食材中的主要呈味基礎(chǔ)物質(zhì)之一，食材的風(fēng)味口感與其呈味氨基酸的含量和比例密切相關(guān)[22]。由圖3 和表1 可知，14 個香菇樣品的共同點是鮮味氨基酸含量最高，甜味和苦味氨基酸含量次之，芳香族氨基酸含量最低。農(nóng)香1號（8.80 mg/g）、香1024（8.68 mg/g）、南山1號（8.82 mg/g）和豫香1 號（7.73 mg/g）中鮮味氨基酸含量最高，均在7 mg/g 以上。豫香1 號中甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸含量均最高，而農(nóng)香3 號中此3 類氨基酸含量均最低。Phe和Tyr屬于芳香族氨基酸，為人體的必需氨基酸，主要存在于乳制品和肉制品中，香菇中含有較少的芳香族氨基酸[19]。食用菌的鮮美滋味是由不同呈味游離氨基酸之間的平衡及相互影響決定的，對食用菌風(fēng)味具有重要作用[21]。

表1 不同品種香菇游離氨基酸TAV值Tab.1 Taste active values of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

圖3 不同品種香菇游離氨基酸呈味特性雷達圖Fig.3 Radar chart of taste values of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

香菇品種間的呈味氨基酸含量差異顯著，但是不同氨基酸對食材風(fēng)味的貢獻還與其味覺閾值直接相關(guān)，因此，采用TAV 對香菇各呈味氨基酸進行分析和比較。一般認為，TAV 越大，表示該呈味物質(zhì)對食材的呈味貢獻越大[19]。由表1 可知，14 種香菇品種中Glu、Asp、Lys、Ala、His、Arg和Val的TAV均大于1。鮮味氨基酸中，貢獻最大的是Glu，其次是Lys 和Asp，值得一提的是，Glu 的TAV（9.29～20.06）是17種呈味氨基酸中的最高值。Glu 和Asp 是味精樣成分，能呈現(xiàn)出較強的鮮味，Glu 的呈味閾值較?。?.3 mg/g），因而其鮮味最強[23]。甜味氨基酸不僅能掩蓋苦澀味，同時能與鮮味氨基酸協(xié)同作用，起到增香增鮮的效果[7，24]。Ala 和His 等甜味氨基酸可表現(xiàn)出舒適的甜味，且其在14 個香菇品種中的TAV均大于1，對香菇風(fēng)味的貢獻較大。14 個香菇品種苦味氨基酸種類較多，且Arg 和Val 的TAV 大于1，這與HOU 等[8]的研究結(jié)果一致，即采用電子舌檢測香菇時會呈現(xiàn)出一定的苦味信號。其他苦味氨基酸的TAV均小于1，但這不一定為劣勢，因為當(dāng)苦味氨基酸（如Ile、Trp等）含量低于呈味閾值時，可有效增強其他呈味氨基酸的呈味效果[19]。豫香1 號中大于味覺閾值的呈味氨基酸數(shù)量最多（9 個），除上述呈味氨基酸外，Met和Ile的TAV 亦大于1，從而賦予豫香1號更為豐富的口感。

2.3 游離氨基酸相關(guān)性分析

對14 個香菇品種含有的17 種游離氨基酸組分進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2 所示。各氨基酸之間有正相關(guān)也有負相關(guān)，且絕大部分呈顯著正相關(guān)。鮮味氨基酸中，Asp 與Glu 呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而Lys 與Asp、Glu 均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。甜味氨基酸中，Thr、Ser、Gly、His 兩兩之間均有極顯著相關(guān)性（P<0.01）?？辔栋被嶂?，Val、Met、Ile、Leu兩兩之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。同時，甜味氨基酸Thr、Pro、Gly、His 與苦味氨基酸Val、Ile、Leu之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。芳香族氨基酸Phe 與Tyr 之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。以上結(jié)果說明，香菇游離氨基酸之間具有較強的相關(guān)性，可通過主成分分析對不同香菇品種進行綜合評價。

表2 不同品種香菇游離氨基酸指標(biāo)間相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

2.4 游離氨基酸的PCA分析

由表3 可知，由于前2 個主成分對應(yīng)特征值均大于1，累計貢獻率為94.11%，基本反映了所有變量的初始信息，故選取前2個主成分，反映不同香菇品種游離氨基酸的大部分信息。

表3 主成分的特征值和貢獻率Tab.3 Eigenvalues of principal components and their contribution rate

因子載荷值反映香菇各氨基酸指標(biāo)對主成分載荷的相對大小和影響的方向，數(shù)值反映原變量對因子影響的大小，正負代表變化方向的差別[20]。如表4所示，第1主成分（PC1）載荷較高的氨基酸指標(biāo)包括Thr、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、Asp、Gly、Pro、His、Ala，載荷值均大于0.8，為高度正相關(guān)。第2 主成分（PC2）Glu 載荷較高（0.76）且為正相關(guān)，Tyr（-0.65）、Trp（-0.60）和Met（-0.60）次之，為負相關(guān)。由此可知，第1 和第2 主成分反映了游離氨基酸的絕大部分信息，包括了5 種甜味氨基酸、5 種苦味氨基酸和全部的鮮味、芳香族氨基酸。

表4 主成分的特征向量與載荷矩陣Tab.4 Principal component eigenvectors and loading matrix

由圖4 可知，14 個香菇樣品具有較好的區(qū)分度，且數(shù)據(jù)點均置于95%置信區(qū)間內(nèi)。大部分品種位于第四象限且聚集較好，說明其含有的游離氨基酸成分和含量相近；農(nóng)香3 號位于第四象限但遠離其他品種，說明其游離氨基酸成分組成和含量與其他品種差異較大；南山1號、農(nóng)香1號和香1024位于第二象限且聚在一起，Glu、Ser 和Arg 對其區(qū)分具有較大的貢獻；豫香1 號位于第三象限，Ile、Val、Leu、Pro、Ala、Met、Tyr、Tro 含量較高，對其分布均有較大的作用。

圖4 不同品種香菇的PCA二維圖Fig.4 PCA bi-plot for different shiitake mushrooms varieties

2.5 游離氨基酸的綜合評價

由于主成分中前2 個組分反映了香菇樣品中17 種游離氨基酸信息的94.11%，因此，利用前2 個組分進行不同品種游離氨基酸的綜合評價是可行的[25]。利用PCA 得到的F1和F2兩個新的綜合指標(biāo)代替原來的17 個指標(biāo)對香菇中的游離氨基酸進行分析，得到前2個主成分線性關(guān)系分別為：

F1=0.07X1+0.07X2+0.06X3+0.08X4+0.07X5+…+0.06X16+0.07X17；

F2=0.05X1-0.06X2-0.19X3-0.05X4-0.08X5+…+0.18X16-0.08X17。

2 個主成分從不同方面反映了不同品種香菇中游離氨基酸的總體水平，單獨使用某一個主成分并不能對其質(zhì)量做出綜合性評價，因此以每個主成分對應(yīng)的方差相對貢獻率作為權(quán)重，對2 個主成分得分進行權(quán)重加和，建立綜合評價函數(shù)F=0.807F1+0.193F2，計算各品種的綜合得分，分?jǐn)?shù)高低可反映不同品種香菇游離氨基酸的綜合品質(zhì)高低。各品種香菇綜合品質(zhì)從高至低的排序為：豫香1 號、香1024、南山1 號、農(nóng)香1 號、香25、香LS、香28、雨花3號、L18、香808、香9608、香931、韓香1號、農(nóng)香3號（表5）。整體來看，14 個香菇品種中，豫香1 號綜合得分最高，為6.78，并且顯著高于其他品種（P<0.05），說明其游離氨基酸綜合質(zhì)量較高。農(nóng)香3號的綜合得分最低，為-4.09，其綜合品質(zhì)較差。

表5 不同品種香菇主成分得分和綜合評價Tab.5 Principal component scores and comprehensive assessment of different shiitake mushrooms varieties

續(xù)表5 不同品種香菇主成分得分和綜合評價Tab.5（Continued） Principal component scores and comprehensive assessment of different shiitake mushrooms varieties

2.6 聚類分析

根據(jù)14 個香菇樣品的全部游離氨基酸組分進行聚類分析，采用歐氏距離和Ward 最小方差法進行系統(tǒng)聚類。由圖5 可知，聚類結(jié)果與PCA 結(jié)果具有很大的一致性，14 個香菇品種聚成4 大類（歐氏距離=2.5）：第1 類為豫香1 號，品質(zhì)最好，除Ser、Arg、Glu、His 外，其余氨基酸含量均為14 個品種中最高；第2 類為農(nóng)香1 號、南山1 號和香1024，品質(zhì)較好，其鮮味化合物Glu、甜味化合物Ser 及苦味氨基酸Arg 的含量最高；第3 類包括香25、香LS、香28、雨花3 號、L18、香808、香9608、香931、韓香1號，游離氨基酸含量比較低；第4 類是農(nóng)香3 號，各氨基酸含量最低，品質(zhì)相對最差。本試驗是統(tǒng)一種植的，排除了氨基酸品質(zhì)受種植區(qū)域環(huán)境（土壤、氣溫）及栽培技術(shù)等因素的影響，較好地反映出香菇不同種質(zhì)間的差異性，因此，本試驗結(jié)果可以為地方特色香菇品種的引種推廣、開發(fā)利用及氨基酸營養(yǎng)價值評價提供良好參考。

圖5 不同品種香菇聚類分析結(jié)果Fig.5 Cluster analysis of different shiitake mushrooms varieties

3 結(jié)論與討論

香菇營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，為更好開發(fā)利用香菇的種質(zhì)資源，發(fā)揮地方品種資源優(yōu)勢，開展不同品種香菇游離氨基酸營養(yǎng)成分分析和綜合評價，篩選主要的滋味活性物質(zhì)，建立了綜合品質(zhì)評價模型，為香菇品種選育和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和評價方法。

本研究對河南省常規(guī)栽培的14 個香菇品種中游離氨基酸的組成及含量進行分析和評價。香菇中含有豐富的游離氨基酸，共檢測到17 種氨基酸，含量為10.91～20.57 mg/g，高于已報道的紅棗（1.753～4.947 mg/g）[25]、芡實（0.98 mg/g）[26]、克氏原螯蝦（4.784～8.835 mg/g）[27]等農(nóng)產(chǎn)品。從單個游離氨基酸所占的最大和最小比例看出，14個香菇品種中各游離氨基酸的比例較均衡，從另外2 個指標(biāo)也可以看出食用菌類的游離氨基酸比例最為理想。一是FAO/WHO 提出必需氨基酸/（必需氨基酸+非必需氨基酸）理想值為40%，14 個香菇品種該值均接近40%；二是必需氨基酸/非必需氨基酸理想值為60%以上，14 個香菇品種該值也均接近或大于60%，尤其是豫香1 號游離氨基酸組成和含量最為符合。該結(jié)果與段靜怡等[21]的研究結(jié)果一致，食用菌是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。

大多數(shù)食用菌有獨特的鮮美味道，與其所含的呈味物質(zhì)有密切關(guān)系，而游離氨基酸中有很大一部分屬于呈味氨基酸，其對食材的口感風(fēng)味有很大貢獻度[21，28?29]。不同香菇品種呈味氨基酸組成模式一致，鮮味氨基酸含量最高，甜味和苦味氨基酸含量次之，芳香族氨基酸含量最低。豫香1號甜味、苦味及芳香族氨基酸含量均最高。Glu 對香菇風(fēng)味的影響最大，TAV 在9.29～20.06，屬于鮮味氨基酸，有效增加香菇的鮮美口味。通過主成分分析從17 種游離氨基酸中提取到2 個主成分，累計方差貢獻率為94.11%，較好地反映香菇游離氨基酸品質(zhì)的綜合信息，并建立綜合評價模型：F=0.807F1+0.193F2，計算得到不同品種香菇游離氨基酸綜合評價得分，得分越高反映該品種香菇游離氨基酸綜合品質(zhì)越好。14 個香菇品種得分從高至低分別為：豫香1 號、香1024、南山1 號、農(nóng)香1 號、香25、香LS、香28、雨花3號、L18、香808、香9608、香931、韓香1 號、農(nóng)香3號。豫香1 號品質(zhì)最好，農(nóng)香3 號品質(zhì)相對最差。采用聚類分析將14 個香菇品種分為4 類，結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，較好地反映香菇不同種質(zhì)間的差異性。

綜上所述，本試驗統(tǒng)一種植，排除了土壤、營養(yǎng)袋、種植模式及栽培技術(shù)等因素影響，較好地反映了品種間游離氨基酸的差異性，因此可以為香菇優(yōu)良品種篩選及產(chǎn)品的開發(fā)利用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。