楊 雪 綜述 曾彩虹 審校

DNAJ熱休克蛋白家族成員B9(DNAJB9)是熱休克蛋白(HSP)40/DNAJ蛋白家族的成員,該蛋白具有分子伴侶的特性,通常作為HSP70的輔助伴侶發(fā)揮作用。這個(gè)家族的成員可以通過其高度保守的J結(jié)構(gòu)域直接與HSP70結(jié)合,刺激其ATP酶活性,從而穩(wěn)定HSP70與底物蛋白之間的相互作用。到目前為止,在人體中共鑒定出41種DNAJ蛋白,而根據(jù)其結(jié)構(gòu)域組成不同可分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類(也稱為A類、B類和C類)[1],DNAJB9屬于Ⅱ類(B類)DNAJ蛋白。本文擬就DNAJB9的結(jié)構(gòu)特征、生理功能及其在多種疾病中的最新研究進(jìn)展作一綜述,為進(jìn)一步探討DNAJB9的作用和相關(guān)疾病的分子機(jī)制提供參考。

DNAJB9的發(fā)現(xiàn)

2001年P(guān)r?ls等[2]首次將DNAJB9描述為“微血管分化基因1(Mdg1)”,通過比較增殖和終末分化時(shí)期微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),DNAJB9基因在分化的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)短暫上調(diào),Mdg1cDNA開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)不僅與DNAJ蛋白家族N端的J結(jié)構(gòu)域具有高度相似性,該區(qū)域還可與HSP70相互作用。這表明Mdg1可以作為伴侶蛋白起作用,并很有可能是DNAJ蛋白家族成員之一。2002年,Shen等[3]鑒定出一個(gè)新的哺乳動(dòng)物DNAJ同源蛋白,并將其命名為ERdj4(endoplasmic reticulum-localized DNAJ protein 4)。氨基酸序列檢測(cè)顯示,ERdj4是DNAJ蛋白Ⅱ型亞家族的成員,實(shí)驗(yàn)表明,ERdj4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94共定位,在非洲綠猴腎細(xì)胞COS-1中與免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BiP)共表達(dá),ERdj4的J結(jié)構(gòu)域能以濃度依賴的方式刺激BiP的ATP酶活性,這是第一個(gè)報(bào)道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的Ⅱ型DNAJ同源蛋白。隨后ERdj4被正式命名為DNAJB9。

DNAJB9的結(jié)構(gòu)特征

DNAJ蛋白通常由4個(gè)功能域組成,除了位于N端的由70個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的J結(jié)構(gòu)域之外,還包括富甘氨酸/苯丙氨酸結(jié)構(gòu)域(G/F域),鋅指結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域[4]。DNAJA蛋白(Ⅰ類)包括N端J結(jié)構(gòu)域、G/F域、鋅指結(jié)構(gòu)域;DNAJB蛋白(Ⅱ類)與Ⅰ類相似,只是缺少鋅指結(jié)構(gòu)域;DNAJC蛋白(Ⅲ類)包含位于蛋白質(zhì)任意位置的J結(jié)構(gòu)域(圖1)。除了上述結(jié)構(gòu)域外,一些DNAJ家族成員還含有額外的結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域可能決定了DNAJ蛋白的功能多樣性。例如,DNAJC10由于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶樣結(jié)構(gòu)域和硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的存在,可作為還原酶對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)中錯(cuò)誤的二硫鍵起作用,如DNAJC10能調(diào)控錯(cuò)誤折疊的視紫紅質(zhì)P23H中錯(cuò)誤的二硫鍵[5]。

DNAJB9含有223個(gè)氨基酸,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),屬Ⅱ類蛋白。DNAJB9在所有組織中都有表達(dá),在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富的組織中表達(dá)量更高,如腎、肝和胎盤等[6]。

圖1 DNAJ蛋白和DNAJB9結(jié)構(gòu)示意圖G/F:甘氨酸/苯丙氨酸結(jié)構(gòu)域,TM:跨膜序列,Zn:鋅指結(jié)構(gòu)域

DNAJB9的生理功能

調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膜蛋白和分泌蛋白合成及加工的主要場(chǎng)所,它還可以維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊并與未折疊蛋白在腔內(nèi)大量聚集,以及鈣平衡紊亂的狀態(tài),可啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。肌醇依賴酶1(IRE1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白,可與BiP共同介導(dǎo)UPR。正常情況下IRE1與BiP結(jié)合處于抑制狀態(tài),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),聚集的未折疊蛋白質(zhì)與BiP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,導(dǎo)致BiP解離而激活I(lǐng)RE1,活化的IRE1可通過其下游靶標(biāo)調(diào)控分子伴侶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白等多種蛋白的表達(dá)[7]。Amin-Wetzel等[8]研究發(fā)現(xiàn)DNAJB9是一種IRE1抑制因子,它促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)BiP和IRE1α腔內(nèi)應(yīng)力敏感域(IRE1LD)形成復(fù)合物;研究顯示,DNAJB9是BiP和IRE1LD之間復(fù)合物形成所必需的;DNAJB9與IRE1LD聯(lián)合,通過刺激ATP水解來招募BiP,使IRE1處于抑制狀態(tài)。這些觀察結(jié)果表明,DNAJB9及BiP是UPR的關(guān)鍵監(jiān)管者,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為“代謝感受器”,與內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)建立了廣泛而密切的聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激更是觸發(fā)代謝疾病的重要因素。因此,DNAJB9可能在代謝性疾病中存在一定的治療價(jià)值。

協(xié)助蛋白質(zhì)降解及合成組裝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ERAD)是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的重要途徑,它承擔(dān)著對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白的識(shí)別、分檢和降解,清除無功能蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累[9]。多項(xiàng)研究證實(shí)[10-12],DNAJB9通過ERAD途徑發(fā)揮降解靶蛋白的作用。Dong等[11]發(fā)現(xiàn),DNAJB9與人類間質(zhì)性肺疾病中錯(cuò)誤折疊的編碼表面活性蛋白C(SP-C)存在相互作用,敲除DNAJB9后異常折疊SP-C的降解被抑制,在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中DNAJB9的表達(dá)恢復(fù)也可顯著恢復(fù)異常SP-C的快速降解,說明DNAJB9在錯(cuò)誤折疊的SP-C蛋白的降解中起著重要作用。Huang等[12]利用蛋白質(zhì)芯片發(fā)現(xiàn)了囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(CFTR)與DNAJB9也存在相互作用,在野生型小鼠中基因消融DNAJB9可觀察到CFTR的表達(dá)增加,并且增強(qiáng)了腸內(nèi)CFTR依賴的液體分泌;DNAJB9敲除的囊性纖維化小鼠腸內(nèi)液體分泌顯著增加。這表明DNAJB9可能是CFTR通過ERAD通路降解的限速因子,也可能是囊性纖維化的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、代謝和免疫的蛋白激酶,主要通過Raptor-mTOR (mTORC1)和Rictor-mTOR (mTORC2)兩種復(fù)合物發(fā)揮其生物學(xué)功能[13]。最新研究證明[14],DNAJB9與mTORC2存在直接相互作用,在Rictor和mTOR組裝為mTORC2之前,DNAJB9已處于分別和兩者結(jié)合的狀態(tài),并且DNAJB9起了促進(jìn)mTOR2復(fù)合物組裝的作用。mTOR信號(hào)失調(diào)與代謝紊亂、神經(jīng)退行性變、癌癥和衰老有關(guān),為以上疾病的進(jìn)一步研究提供新思路。

抑制細(xì)胞凋亡及衰老迄今為止,DNAJB9已知的功能主要與分子伴侶蛋白有關(guān),而其確切的細(xì)胞功能尚不清楚。2015年Lee等[15]首次報(bào)道了DNAJB9與細(xì)胞凋亡存在聯(lián)系。p53是一種重要的腫瘤抑制因子,其突變與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)。DNA損傷時(shí),p53被激活,誘導(dǎo)其下游靶基因的表達(dá)從而使得細(xì)胞周期阻滯、衰老或凋亡,抑制了細(xì)胞增殖[16]。Lee等[15]研究發(fā)現(xiàn)基因毒性刺激下,p53可通過Ras/Raf/ERK途徑誘導(dǎo)DNAJB9表達(dá)增加;DNAJB9與p53存在相互作用,而在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和人骨肉瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞株中沉默DNAJB9表達(dá)后,p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平顯著增加,這些證據(jù)提示DNAJB9可能通過與p53的相互作用來抑制p53的促凋亡功能。以上這些結(jié)果表明,DNAJB9不僅是p53的下游靶點(diǎn),還是p53的一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。最新的研究證明[17],DNAJB9還是一種抗衰老因子和可能的原癌基因:在小鼠原代成纖維細(xì)胞中,DNAJB9過表達(dá)抑制了p53導(dǎo)致的衰老,并在致癌基因RAS激活時(shí)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。由于DNAJB9是協(xié)同分子伴侶,其本質(zhì)是一種結(jié)合蛋白,因此DNAJB9有可能除p53外還可以與Rb等其他衰老調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞衰老并促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些推測(cè)都需要深入的研究來闡明這種可能性,DNAJB9確切的細(xì)胞功能也可能是今后的一個(gè)研究重點(diǎn)。

DNAJB9與疾病的關(guān)系

腫瘤乳腺癌是婦女中最常見的惡性腫瘤,也是全世界惡性腫瘤死亡的第五大原因[18]。三陰性乳腺癌(TNBC) 占所有乳腺癌的10%～20%,是乳腺癌中最具侵襲性的分子亞型,其特點(diǎn)是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡率高,預(yù)后最差[19]?；熓侵委烼NBC的主要手段,但目前臨床療效仍然不理想。Kim等[20]發(fā)現(xiàn)DNAJB9在乳腺癌組織中表達(dá)降低,DNAJB9的表達(dá)水平降低與患者惡性腫瘤侵襲性增加、總生存率縮短相關(guān)。另外有研究表明[21],條件性敲除基質(zhì)成纖維細(xì)胞中ZEB1基因后,小鼠乳腺上皮性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移都得到了抑制,同時(shí)顯著延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間。Kim等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在機(jī)制上,DNAJB9可通過穩(wěn)定F盒蛋白45(FBXO45),誘導(dǎo)ZEB1泛素化并促進(jìn)其降解,從而顯著抑制了TNBC的轉(zhuǎn)移及侵襲。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DNAJB9可能是乳腺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物,并突出了DNAJB9-FBXO45軸在TNBC中的治療價(jià)值。

DNAJB9可能在腫瘤化療耐藥上也發(fā)揮著一定作用。急性髓系白血病(AML)是一種常見的具有侵襲性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤?；熌退幨茿ML治療效果不佳的重要原因。Wang等[22]篩選了AML中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)的全基因組表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)與供者相比,小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)在AML患者中異常高表達(dá),下調(diào)SNHG5表達(dá)后AML細(xì)胞對(duì)化療的敏感度增加;而在AML細(xì)胞中,DNAJB9表達(dá)與miR-32呈負(fù)相關(guān),與SNHG5呈正相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)阿霉素處理人早幼粒白血病細(xì)胞HL60后DNAJB9表達(dá)升高,證實(shí)了SNHG5通過靶向miR-32/DNAJB9軸調(diào)控化療耐藥。并且進(jìn)一步的結(jié)果顯示, SNHG5/miR-32/DNAJB9軸是通過自噬來調(diào)節(jié)AML細(xì)胞的化療耐藥。這揭示了AML一個(gè)重要的化療耐藥機(jī)制。

肥胖最近研究發(fā)現(xiàn)[14],DNAJB9與肝臟的能量代謝密切相關(guān)。Sun等[14]構(gòu)建了肝臟特異性DNAJB9敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠合成代謝受到抑制,分解代謝信號(hào)增強(qiáng);肝臟顯著縮小。并且DNAJB9敲除小鼠肝臟脂質(zhì)積累明顯增加,提示DNAJB9缺失后肝臟的代謝編程從蛋白質(zhì)合成向脂質(zhì)積累轉(zhuǎn)變。體外實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)DNAJB9后細(xì)胞中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1c)的表達(dá)減少,使用ERAD抑制劑NMS-873后緩解了DNAJB9誘導(dǎo)的SREBP1c下調(diào)。此外, SREBP1c的敲低減輕了DNAJB9缺乏所誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性,這些結(jié)果提示DNAJB9通過調(diào)控SREBP1c的降解來調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)沉積。

Sun等[14]還發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠肝臟DNAJB9表達(dá)顯著下調(diào);而重新表達(dá)DNAJB9的肥胖小鼠肝臟中mTORC2信號(hào)顯著增加, 糖酵解酶誘導(dǎo)增加,氨基酸分解代謝降低, SREBP1c的表達(dá)被有效抑制,在肥胖小鼠中觀察到的代謝水平紊亂基本上得到了恢復(fù),肥胖程度也顯著減輕。這表明DNAJB9可能參與肥胖甚至是肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制。

纖維性腎小球腎炎(FGN)DNAJB9在正常腎臟中的生理功能目前少見報(bào)道。目前唯一已知的與DNAJB9細(xì)胞外沉積有關(guān)的腎臟疾病是FGN。

FGN是一種極為罕見的腎小球腎炎,約占自體腎活檢的0.5%～1%,以大量蛋白尿、腎病綜合征和高血壓為主要癥狀,預(yù)后較差。最初認(rèn)為FGN主要特征是電鏡下腎小球內(nèi)見隨機(jī)無分支、無序排列的纖維絲,直徑15～25 nm,大于淀粉樣變性(AMY)的淀粉絲;剛果紅陰性。免疫電鏡證實(shí)纖維絲和IgG、κ、λ、C3 等共沉積,提示纖維絲為免疫球蛋白來源,也有可能是不確定的前體蛋白形成纖維絲后IgG 與之結(jié)合[23]。有研究報(bào)道[24-25],FGN的發(fā)病可能與惡性腫瘤、丙型肝炎病毒感染和自身免疫性疾病有關(guān)。根據(jù)FGN的伴發(fā)疾病及病理特點(diǎn),目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與免疫球蛋白沉積有關(guān)。但具體機(jī)制尚不明確。

2018年,Andeen等[26]利用激光捕獲顯微解剖技術(shù)分離腎小球并質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示，與腎臟AMY及正常人相比,DNAJB9是僅在FGN腎小球中檢測(cè)到的高表達(dá)蛋白,DNAJB9免疫組化染色也證實(shí)了這一結(jié)果,且其分布與免疫沉積物相似[27]。同樣,Dasari等[28]證實(shí)DNAJB9是FGN腎小球中含量第四豐富的蛋白,且僅在24例FGN患者腎小球中高表達(dá)。DNAJB9免疫組化對(duì)FGN的敏感度和特異度分別為98%和99%[29]。隨后Nasr等[30]于2019年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FGN患者血清DNAJB9水平比對(duì)照組(包括患有其他腎小球疾病的患者)高達(dá)4倍。血清DNAJB9水平不僅與FGN患者的腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān),還可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)FGN,敏感度中等(67%),特異度高(98%)。這些結(jié)果提示DNAJB9是診斷FGN強(qiáng)有力的生物標(biāo)志物,也極有可能參與了FGN的發(fā)病機(jī)制。

隨著DNAJB9作為FGN診斷標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn),越來越多的研究著眼于對(duì)FGN的形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)及其具體分類的重新認(rèn)識(shí)。目前認(rèn)為少數(shù)DNAJB9陰性的FGN可能是一種特殊的亞型。此外,經(jīng)報(bào)道4%～5%的DNAJB9陽性的FGN病例表現(xiàn)出特殊的嗜血管性,易被誤診為AMY[31]。Alexander等[32]報(bào)道了18例腎活檢結(jié)果符合FGN但剛果紅染色陽性呈AMY改變樣的患者,免疫組化腎小球DNAJB9呈強(qiáng)陽性,蛋白組學(xué)分析顯示載脂蛋白E(APOE)及血清淀粉樣P 物質(zhì)(SAP)表達(dá)較剛果紅陰性FGN者增加,這提示FGN中的嗜血管性可能與APOE的增加有關(guān)。這些病例最終經(jīng)質(zhì)譜分析后被診斷為嗜血管性FGN。隨后,梁少姍等[33]回顧性分析了6例DNAJB9陽性且經(jīng)腎活檢確診為FGN的病例,其中有3例為剛果紅陽性。這提示DNAJB9在區(qū)分FGN及AMY上有重要的鑒別價(jià)值。

另外,約0.9%的FGN表現(xiàn)為IgG陰性。Said等[34]最新報(bào)道了9例免疫球蛋白陰性的FGN，患者出現(xiàn)蛋白尿、血尿,血清肌酐水平升高。其中有3例患有癌癥,2例存在丙型肝炎病毒感染;組織學(xué)上,腎小球DNAJB9染色陽性,在冷凍組織和石蠟組織上的免疫球蛋白熒光染色皆為陰性。超微結(jié)構(gòu)上,直徑13～20 nm的纖維絲隨機(jī)排列。由此可見,少數(shù)FGN與腎小球免疫球蛋白沉積無關(guān),可以通過DNAJB9免疫染色確定FGN的診斷。

目前FGN發(fā)病的具體機(jī)制仍不清楚,DNAJB9在其發(fā)病中的作用存在多種猜想,有專家推測(cè)錯(cuò)誤折疊的DNAJB9可能是一種新的自身抗原,FGN則是其與自身抗體結(jié)合導(dǎo)致的自身免疫性疾病。但目前尚未發(fā)現(xiàn)循環(huán)中抗DNAJB9抗體的存在[27]。另有學(xué)者提出DNAJB9本身并非自身抗原,而是通過識(shí)別結(jié)合錯(cuò)誤折疊的IgG,導(dǎo)致FGN纖維樣結(jié)構(gòu)的形成[35]。這與之前認(rèn)為免疫球蛋白沉積是FGN重要致病機(jī)制的觀點(diǎn)相符。最近,Said等[34]發(fā)現(xiàn)IgG陰性的FGN患者,他們由此猜測(cè)在纖維絲形成過程中發(fā)揮作用的是DNAJB9而非IgG。基于上述內(nèi)容,關(guān)于DNAJB9在FGN致病機(jī)制中的作用意見不一。FGN的本質(zhì)是一種由IgG引起的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的疾病,還是一種伴隨或不伴隨繼發(fā)性自身免疫反應(yīng)的蛋白錯(cuò)誤折疊疾病,也有待商榷。這些都將是之后的研究重點(diǎn)。

小結(jié):DNAJB9是存在于真核生物的一種保守的分子伴侶蛋白,已證實(shí)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位與功能有關(guān),如調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和靶蛋白的組裝降解等。近年來研究表明,DNAJB9與腫瘤及代謝等多種疾病密切相關(guān),并發(fā)現(xiàn)其為診斷FGN的特異度標(biāo)志物。迄今為止,FGN的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。DNAJB9在FGN發(fā)病機(jī)制及病理生理中的具體作用和機(jī)制仍有待深入研究。