王永芳 王 斌 王效春

糖尿病、高血壓、慢性腎臟病(CKD)患者在使用碘對比劑(CM)后發(fā)生急性腎損傷(AKI)的風(fēng)險增加。近期美國放射學(xué)會發(fā)布的專家共識將對比劑相關(guān)的急性腎損傷(CA-AKI)定義為CM注射后48 h內(nèi)所發(fā)生的任何AKI[1-3]。除水化之外,目前臨床上尚無有效的防治措施[4],因此,尋找防治CA-AKI的藥物具有重要臨床意義。

研究表明,CA-AKI的發(fā)病機制主要與缺氧、氧化應(yīng)激、腎間質(zhì)纖維化及腎小管細胞凋亡等有關(guān)[5]。沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(SIRT1)具有阻斷缺氧、抑制氧化應(yīng)激、腎纖維化及細胞凋亡的作用[5]。白藜蘆醇作為SIRT1激動劑,具有廣泛的生物學(xué)活性[6],在順鉑誘導(dǎo)的AKI、CKD、老年鼠腎小管間質(zhì)損傷中通過調(diào)控SIRT1發(fā)揮保護作用[7-9]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在CA-AKI中發(fā)揮缺氧適應(yīng)的作用[10]。然而白藜蘆醇是否通過SIRT1與HIF-1α影響CA-AKI尚未見報道。

血氧水平依賴磁共振成像(BOLD)是通過檢測血液中氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的比例無創(chuàng)反映組織氧含量的影像學(xué)手段[11],表觀橫向弛豫速率(R2*)可反映組織缺氧情況,實驗證實R2*值與微電極測量數(shù)據(jù)的一致性較好[12]。本研究采用BOLD技術(shù)探索白藜蘆醇在CA-AKI中的作用和機制,旨在為臨床尋找預(yù)防CA-AKI的藥物靶點提供方向。

材料與方法

實驗動物及分組雄性實驗兔24只,8周齡左右,體重2.5±0.5 kg。所有實驗兔自由飲食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按隨機數(shù)表法分為對照組、白藜蘆醇組(Res組)、對比劑相關(guān)的AKI組(CA-AKI組)、白藜蘆醇治療組(CA-AKI+Res組),每組6只。Res組和CA-AKI+Res組,給予白藜蘆醇按80 mg/(kg·d)口服,連續(xù)14 d[5]。CA-AKI組和CA-AKI+Res組,通過耳緣靜脈推注碘海醇(350 mg I/mL),劑量為2.5 g I/kg[13]。CA-AKI+Res組在白藜蘆醇灌藥14 d后注入碘海醇,對照組注射等量生理鹽水。所有實驗兔在模型建好后第3天行BOLD技術(shù)掃描。

儀器與方法實驗兔肌肉注射速眠新0.2 mL、3%戊巴比妥鈉0.5 mL/kg,待麻醉30 min后,采用GE 3.0T磁共振掃描儀(美國通用電氣)及8通道心臟線圈進行BOLD技術(shù)掃描,仰臥位,頭先進。BOLD圖像掃描參數(shù)如表1所示。掃描結(jié)束后立即過量麻醉處死實驗兔,取雙腎標本,去除包膜,左腎液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存,用于Western Blot實驗,右腎于4%多聚甲醛固定用于病理、Masson及免疫組化實驗。

表1 BOLD掃描參數(shù)

BOLD圖像后處理利用GE adw 4.6后處理工作站軟件進行BOLD圖像后處理,由兩名MRI醫(yī)師在右腎皮質(zhì)(CO)和外髓(OM)分別選擇感興趣區(qū)(ROI),每個條帶選取3個ROI測量R2*值[14],取平均值(圖1A)。

生化指標檢測各組實驗兔建好模型第3天時,經(jīng)耳緣靜脈采血2.5 mL,檢測胱抑素C(CysC),經(jīng)膀胱抽取尿液2.5 mL,檢測中性粒細胞相關(guān)載脂蛋白酶(NGAL),在4 ℃低溫離心機離心(3 600 rpm)10 min,取上清液,采用NGAL、CysC ELISA試劑盒(上海遠幕生物科技有限公司)按說明書進行檢測。

病理組織學(xué)分析常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化后行HE染色、Masson染色及免疫組化染色。在400倍光鏡下隨機選取5個視野,根據(jù)腎小管細胞脫落、壞死、胞質(zhì)空泡、腎小管管腔擴張及碎屑積聚等所占百分比進行評分。評分標準:0,正常;1,≤5%;2,5%～25%;3,25%～75%;4,75%～100%[5]。使用《Image J》軟件量化膠原纖維沉積及SIRT1、HIF-1α、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)陽性細胞的百分比。

WesternBlot測定蛋白表達量選用SIRT1抗體(absin,中國);HIF-1α抗體(Novus,美國);B細胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體(ProteinTech,中國);Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ProteinTech,中國);活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗體(Abcam,英國);細胞色素C(Cyt-C)抗體(Novus,美國);依次檢測。

統(tǒng)計學(xué)分析采用《SPSS 22.0》軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)性檢驗時,以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析及Bonferroni進行事后檢驗。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)時,采用Kruskal-Wallis test及Friedman test進行檢驗。R2*值與病理評分及HIF-1α評分采用Spearman進行相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

血液和尿液指標與對照組相比,CA-AKI組血液CysC和尿液NGAL值明顯升高(P均<0.001);與CA-AKI組相比,CA-AKI+Res組中血液CysC(P=0.034)和尿液NGAL值明顯下降(P=0.002)(表2)。

表2 各組血液CysC和尿液NGAL檢查結(jié)果及R2*值的變化

R2*值與對照組相比,CA-AKI組CO和OM帶R2*值顯著升高(P<0.001;P<0.001);與CA-AKI組相比,CA-AKI+Res組腎臟CO和OM帶R2*值顯著下降(P=0.015;P=0.002)(表2、圖1)。

圖1 各組血氧水平依賴磁共振成像技術(shù)圖像R2*:表觀橫向弛豫速率;Res組:白藜蘆醇組;CA-AKI組:對比劑相關(guān)的急性腎損傷組;CA-AKI+Res組:白藜蘆醇治療組;A:偽彩圖及感興趣區(qū)勾畫;B:R2*值;*：與對照組相比,P<0.05;#：與CA-AKI組相比,P<0.05

腎臟病理損傷與對照組相比,CA-AKI組病理評分顯著升高(P<0.001);與CA-AKI組相比,CA-AKI+Res組病理評分明顯下降(P<0.001);與對照組相比,CA-AKI組間質(zhì)膠原纖維沉積量增多(P<0.001);與CA-AKI組相比,CA-AKI+Res組間質(zhì)膠原纖維沉積量明顯下降(P<0.001)。相關(guān)性分析顯示:腎臟病理評分與R2*值呈顯著正相關(guān)(r=0.796 0,P<0.000 1)(圖2)。

圖2 A:CA-AKI組腎臟病理損傷最重，經(jīng)白藜蘆醇治療后，CA-AKI+Res組腎臟病理損傷明顯改善(HE，×400);B:CA-AKI組腎臟膠原纖維沉積量最多，經(jīng)白藜蘆醇治療后，CA-AKI+Res組腎臟膠原纖維沉積量減少(Masson染色，×400);C:病理評分;D:膠原纖維沉積量分析;E:R2*值與腎臟病理評分相關(guān)性分析R2*:表觀橫向弛豫速率;Res組:白藜蘆醇組;CA-AKI組:對比劑相關(guān)的急性腎損傷組;CA-AKI+Res組:白藜蘆醇治療組；*：與對照組相比,P<0.05;#：與CA-AKI組相比,P<0.05

腎臟免疫組織化學(xué)染色與對照組相比,CA-AKI組中SIRT1蛋白表達下降(P=0.045),HIF-1α蛋白表達明顯升高(P<0.001),cleaved caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.001);與CA-AKI組相比,經(jīng)白藜蘆醇治療后CA-AKI+Res組SIRT1蛋白表達明顯升高(P<0.001),HIF-1α蛋白表達下降(P=0.020),cleaved caspase-3蛋白表達下降(P=0.036)(圖3A～F);相關(guān)性分析顯示:HIF-1α表達與R2*值呈顯著正相關(guān)(r=0.867 5,P<0.000 1)(圖3G)。

圖3 A:CA-AKI組SIRT1蛋白表達量最少，經(jīng)白藜蘆醇治療后，CA-AKI+Res組SIRT1蛋白表達量明顯增多(SIRT1染色，×400);B：CA-AKI組HIF-1α蛋白表達量最多，經(jīng)白藜蘆醇治療后，CA-AKI+Res組HIF-1α蛋白表達量下降(HIF-1α染色，×400);C:CA-AKI組cleaved caspase-3蛋白表達量最多，經(jīng)白藜蘆醇治療后，CA-AKI+Res組cleaved caspase-3蛋白表達量下降(cleaved caspase-3染色，×400);D:SIRT1陽性表達分數(shù);E:HIF-1α陽性表達分數(shù);F:cleaved caspase-3陽性表達分數(shù);G:R2*值與HIF-1α表達相關(guān)性分析SIRT1:沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1;HIF-1α:缺氧誘導(dǎo)因子1α;cleaved caspase-3:活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;R2*:表觀橫向弛豫速率;Res組:白藜蘆醇組;CA-AKI組:對比劑相關(guān)的急性腎損傷組;CA-AKI+Res組:白藜蘆醇治療組;*：與對照組相比,P<0.05;#：與CA-AKI組相比,P<0.05

腎組織SIRT1/HIF-1α信號通路蛋白與對照組相比,CA-AKI組中SIRT1蛋白表達下降(P=0.012),HIF-1α蛋白表達明顯升高(P<0.001);與CA-AKI組相比,經(jīng)白藜蘆醇治療后CA-AKI+Res組SIRT1(P<0.001)表達上升,HIF-1α蛋白表達下降(P<0.001),HIF-1α下游蛋白Bax(P=0.024)、Cyt-C(P=0.037)、cleaved caspase-3(P=0.020)蛋白也顯著下降,而Bcl-2蛋白升高(P=0.014)(圖4)。

圖4 各組SIRT1/HIF-1α信號通路各蛋白表達SIRT1:沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1;HIF-1α:缺氧誘導(dǎo)因子-1α;Bcl-2:B細胞淋巴瘤2;Bax:Bcl-2相關(guān)X蛋白;cleaved caspase-3:活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;Cyt-C:細胞色素C;β-actin:β肌動蛋白;Res組:白藜蘆醇組;CA-AKI組:對比劑相關(guān)的急性腎損傷組;CA-AKI+Res組:白藜蘆醇治療組;A:SIRT1、HIF-1α及下游靶蛋白表達;B:SIRT1、HIF-1α及下游靶蛋白表達評分;*：與對照組相比,P<0.05;#：與CA-AKI組相比,P<0.05

討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過上調(diào)SIRT1蛋白,改善CA-AKI的腎功能,減輕腎小管壞死,緩解腎臟缺氧,抑制了腎纖維化及腎小管細胞的凋亡,而BOLD技術(shù)可用于評價白藜蘆醇的保護作用。

白藜蘆醇對CA-AKI的保護作用可能與以下機制有關(guān):(1)白藜蘆醇通過調(diào)控SIRT1的表達,緩解對比劑自身的毒性作用,減少腎小管上皮細胞的損傷和凋亡[6]。因為在CA-AKI+Res模型中,白藜蘆醇通過調(diào)控SIRT1,降低了凋亡相關(guān)蛋白Bax,cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白的表達,同時增加了Bcl-2蛋白的表達,進而發(fā)揮了抑制凋亡的作用;(2)白藜蘆醇通過SIRT1改善了CA-AKI導(dǎo)致的腎功能受損。因為白藜蘆醇作用于CA-AKI后 CysC和NGAL明顯降低,證實了白藜蘆醇可促使腎臟提高肌酐清除率,降低腎小管細胞的損傷;(3)白藜蘆醇通過調(diào)控SIRT1緩解了腎臟纖維化程度,Masson染色可以證實這一點。在臨床中,對CA-AKI患者而言,抑制其腎纖維化可以防止CA-AKI向持續(xù)性腎功能不全進展。據(jù)報道,與傳統(tǒng)觀點認為CA-AKI是一過性腎損傷所不同,如今更多證據(jù)證明患者一旦發(fā)生CA-AKI后,腎臟功能并不能完全恢復(fù),其進展為持續(xù)性腎功能不全風(fēng)險達40%,發(fā)展為終末期腎衰竭風(fēng)險高達8%[3]。因此,利用白藜蘆醇抑制CA-AKI患者腎纖維化進展,將有助于防止其向腎功能不全發(fā)展,進而阻止CKD的發(fā)生。CA-AKI發(fā)生腎纖維化的過程有幾個關(guān)鍵階段,包括細胞外基質(zhì)的過度積聚、腎間質(zhì)成纖維細胞的激活、上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和炎性細胞浸潤及線粒體功能受損[15]。研究表明白藜蘆醇上調(diào)SIRT1后可能作用于其下游的靶蛋白[如轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1)、過氧化物酶體增殖激活受體共激活因子1α(PGC-1α)及核因子κB(NF-κB)等]發(fā)揮作用有關(guān)[16-17],相關(guān)研究有待于今后實驗進一步證實。

我們先前在CA-AKI研究中發(fā)現(xiàn)腎臟缺氧會引起HIF-1α表達升高[18],而且已有證據(jù)表明缺氧在CA-AKI中扮演重要角色[19]。CA-AKI患者在注入CM后會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞受損發(fā)生缺氧,而缺氧會破壞細胞線粒體有氧代謝,進而導(dǎo)致活性氧大量聚集,造成氧化應(yīng)激反應(yīng)加重,導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷,轉(zhuǎn)運功能發(fā)生異常,進一步加劇CA-AKI缺氧,HIF-1α表達升高[20]。此外,對比劑自身毒性作用促使腎血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡,炎癥反應(yīng)加劇,導(dǎo)致腎組織低灌注和缺氧,反過來將加劇CM本身造成的腎臟損傷,促進HIF-1α表達升高[21]。本研究證實:白藜蘆醇通過上調(diào)SIRT1調(diào)控HIF-1α蛋白本身及其下游的靶蛋白,并通過復(fù)雜的信號通路在CA-AKI中發(fā)揮保護作用。隨著SIRT1蛋白表達上升,HIF-1α蛋白表達下降,腎臟缺氧逐漸改善,BOLD技術(shù)也進一步發(fā)現(xiàn)經(jīng)白藜蘆醇治療后CA-AKI+Res組實驗兔腎臟各帶R2*值較CA-AKI組明顯減低(CO帶:P=0.015;OM帶:P=0.002),說明白藜蘆醇可以有效抑制CA-AKI的急性缺氧。同時數(shù)據(jù)也顯示R2*值與HIF-1α表達具有顯著相關(guān)性,證實了BOLD技術(shù)在評估白藜蘆醇對CA-AKI的保護作用中的價值。

本研究尚存在以下不足:(1)實驗兔數(shù)量較少,未來實驗應(yīng)進一步增加實驗兔數(shù)量,同時需增加SIRT1抑制劑組來證實結(jié)果的可靠性;(2)本研究利用BOLD技術(shù)評估白藜蘆醇的保護作用,但BOLD技術(shù)存在受血容量體積分數(shù)及氧解離曲線影響[22],有待進一步改進;(3)BOLD圖像后處理時采用手動勾畫ROI,盡管本研究已測量三次取平均值,但仍存在一定誤差;(4)今后研究應(yīng)從細胞水平進一步驗證白藜蘆醇在CA-AKI中的作用。

小結(jié):本研究結(jié)果證實白藜蘆醇在CA-AKI中發(fā)揮保護作用,其通過促進SIRT1蛋白表達,抑制HIF-1α蛋白升高發(fā)揮抗缺氧、抗細胞凋亡、防止腎纖維化和抑制腎功能受損的作用。BOLD技術(shù)可用于評估白藜蘆醇對CA-AKI的保護作用?？傊?了解白藜蘆醇和CA-AKI的關(guān)系將有助于臨床給予有效的干預(yù),對患者在使用CM時避免發(fā)生CA-AKI提供理論依據(jù)。