徐啟明 劉偉偉 路建饒

慢性腎臟病(CKD)是不同原因?qū)е侣阅I臟結(jié)構(gòu)與功能的障礙[1]。中國(guó) CKD發(fā)生率約10.8%[2],其中約10%的患者最終將進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)。CKD給社會(huì)和人民造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。

鐵死亡是一種鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物積累到致死水平的新型的細(xì)胞程序性死亡方式。近幾十年來(lái),在腎臟疾病領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)以鐵死亡為代表的非傳統(tǒng)形式的細(xì)胞死亡,盡管不斷探索鐵死亡和急性腎損傷(AKI)之間的相互作用[3],但對(duì)鐵死亡和CKD的研究仍然有限。通過(guò)明確鐵死亡與CKD的共同發(fā)生機(jī)制,預(yù)測(cè)鐵死亡對(duì)CKD的治療潛力,以期為鐵死亡和CKD提供見(jiàn)解[4]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析從鐵死亡角度篩選出治療CKD的天然藥物成分,以期在CKD的治療方法上取得進(jìn)展。

材料與方法

CKD數(shù)據(jù)集的收集及篩選差異基因通過(guò)在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[5]下載GSE66494和GSE120683數(shù)據(jù)集,運(yùn)用R軟件對(duì)這兩組數(shù)據(jù)集行標(biāo)準(zhǔn)化處理,后用ggord包進(jìn)行主成分析(PCA),繪制去除批次后的PCA結(jié)果圖,接下來(lái)使用limma包(版本3.40.2)研究mRNA的差異表達(dá)。

鐵死亡相關(guān)基因收集及交集基因的獲取通過(guò)FerrDb平臺(tái)[6]獲取與鐵死亡相關(guān)的基因,再將上述步驟中得到的差異表達(dá)基因(DEGs)與鐵死亡相關(guān)基因?qū)雑venn平臺(tái)[7]進(jìn)行取交集操作,并獲得交集基因的Venn圖。

交集基因進(jìn)行功能富集分析(GO及KEGG)為了進(jìn)一步了解上述篩選出的基因的研究信息,將分析得到的交集基因?qū)胫蠷軟件中,并運(yùn)用clusterProfiler、pathview等R包進(jìn)行GO及KEGG分析,以期得到鐵死亡干預(yù)CKD的可能途徑。

蛋白互助網(wǎng)絡(luò)(PPI)蛋白互助網(wǎng)絡(luò)分析將上述獲得的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)[8]來(lái)檢索相互作用基因以構(gòu)建PPI,再將其導(dǎo)入Cytoscape軟件揭示PPI網(wǎng)絡(luò)中具有高度連接節(jié)點(diǎn)的中心基因。

通過(guò)鐵死亡治療CKD的天然藥物及成分篩選symMap平臺(tái)[9]是一個(gè)中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù),將上述獲得的交集基因輸入,獲得通過(guò)鐵死亡治療CKD的天然藥物。再將預(yù)測(cè)排名靠前的中草藥導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[10]中,通過(guò)“口服生物利用度>30%”、“類藥性>0.18”、“藥物半衰期≥4h”及“分子量介于180～500 Da”篩選有效成分,并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[11]對(duì)所有靶點(diǎn)ID進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

分子對(duì)接驗(yàn)證通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與鐵死亡相關(guān)的CKD核心靶點(diǎn)，比對(duì)得到預(yù)測(cè)天然藥物小分子的靶點(diǎn),利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[12]下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),再利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)[13]得到的天然藥物sdf格式。運(yùn)用MOE軟件將小分子化合物及靶蛋白進(jìn)行對(duì)接。

結(jié) 果

CKD中DEGs篩選本研究中,通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了GSE66494和GSE120683數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)特征。其中,GSE66494微陣列數(shù)據(jù)共有53份活檢標(biāo)本,GSE120683微陣列數(shù)據(jù)包括6個(gè)樣本,對(duì)具體成分的進(jìn)一步分析表明,兩數(shù)據(jù)集均為探索人類CKD的基因表達(dá)譜,包含著CKD中與腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管上皮細(xì)胞損傷相關(guān)的負(fù)責(zé)基因。

首先將2個(gè)數(shù)據(jù)集標(biāo)記為不同批次,采用removeBatchEffect函數(shù)進(jìn)行去除批次效應(yīng),通過(guò)箱線圖進(jìn)行評(píng)估數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化情況(圖1A),結(jié)果顯示,樣本的中位數(shù)基本位于一條水平直線,提示基因芯片質(zhì)量良好,兩分組之間的數(shù)據(jù)具有比較意義;數(shù)據(jù)批次效應(yīng)情況通過(guò)對(duì)比批次去除前后可視化PCA圖進(jìn)行評(píng)估(圖1B、C),提示可繼續(xù)用于下一步的研究。然后提取兩個(gè)數(shù)據(jù)集共有的gene symbol,一共得到了1 021個(gè)DEGs,其中包含221個(gè)上調(diào)基因和800個(gè)下調(diào)基因,并以“AdjustedP<0.05且log2(倍數(shù)變化)>1或log2(倍數(shù)變化) <-1”為初步篩選條件繪制火山圖(圖1D)以及熱圖(圖1E)。

圖1 慢性腎臟病中差異表達(dá)基因篩選A:數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后箱線圖;B、C:兩個(gè)數(shù)據(jù)集批次去除前、后的PCA結(jié)果;D:差異基因火山圖;E:差異基因表達(dá)熱圖

CKD差異表達(dá)與鐵死亡交集基因我們從FerrDb平臺(tái)獲取與鐵死亡相關(guān)的基因共259個(gè),將該基因與上述步驟中得到的有關(guān)CKD的DEGs匯總后,通過(guò)jvenn平臺(tái)做取交集處理(圖2),共得到交集基因18個(gè),這些靶點(diǎn)代表著同時(shí)參與鐵死亡過(guò)程及CKD的發(fā)生。

圖2 交集基因的Venn圖

GO與KEGG功能富集分析上述步驟中得到的18個(gè)交集基因,運(yùn)用clusterProfiler,pathview等R包進(jìn)行GO及KEGG功能注釋。GO分析共獲得393個(gè)條目,其中生物過(guò)程(BP)共有325條,細(xì)胞組分(CC)共有12條,分子功能(MF)共有56條。選取差異最顯著的10個(gè)功能進(jìn)行排序分析(圖3),BP主要涉及細(xì)胞解毒,有機(jī)酸分解代謝過(guò)程,細(xì)胞對(duì)皮質(zhì)類固醇的反應(yīng)等功能;CC主要涉及核膜,內(nèi)吞作用的囊腔及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等功能簇;MF主要涉及氧氣結(jié)合,氧化還原酶活性,抗氧化活性等功能簇。

圖3 GO功能富集分析的BP、CC、MF三合一條形圖BP:生物過(guò)程;CC:細(xì)胞組分;MF:分子功能

KEGG功能富集分析表明上述基因主要富集于60條信號(hào)通路,再以“P<0.05”為篩選條件,最終得到9條信號(hào)通路,分別為mTOR信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、甘油磷脂新陳代謝、PI3K-Akt信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路(圖4)。

圖4 KEGG功能富集分析氣泡圖

PPI網(wǎng)絡(luò)分析將上述步驟中得到的交集基因?qū)隨TRING在線分析工具中,得到了交集基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5A),再將PPI 網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中,導(dǎo)出18個(gè)核心基因,分別為PLIN4、ATF3、PCK2、ANGPTL7、TSC22D3、MIOX、ACSF2、PTGS2、DUSP1、CBS、DDIT4、FLT3、TAZ、SLC3A2、ALB、GPT2、LPIN1、HBA1。以度值為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)交集基因進(jìn)行排列,其中排名最高的基因?yàn)锳LB,排名最低的基因?yàn)锳CSF2;FLT3為上調(diào)表達(dá)基因,其余17個(gè)核心基因均為下調(diào)基因(圖5B)。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖A:47個(gè)PPI邊緣和18個(gè)節(jié)點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖;B:中倒置三角形代表下調(diào)基因,三角形代表上調(diào)基因

天然藥物及其成分的篩選將上述得到的18個(gè)核心基因?qū)雜ymMap平臺(tái),以P<0.05為篩選條件,共得到了534味天然藥物,并進(jìn)一步通過(guò)TCMSP及部分文獻(xiàn)檢索其對(duì)應(yīng)來(lái)源天然藥物及作用靶點(diǎn),檸檬酸、香豆雌酚為最有可能治療CKD的天然小分子藥物,其來(lái)源于大黃、蘆薈、虎杖、葛花等。

分子對(duì)接將上述得到的核心靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的天然藥物成分導(dǎo)入Cytoscape軟件中,通過(guò)度值以及與CKD關(guān)聯(lián)度為篩選條件,得到了3個(gè)核心靶點(diǎn),分別為PTGS2、ATF3、GPT2,以及2個(gè)關(guān)鍵活性成分,分別是Citric Acid和Coumestrol(圖6)。通過(guò)MOE軟件計(jì)算3個(gè)核心靶點(diǎn)和2個(gè)關(guān)鍵活性成分間的最低結(jié)合能,分子對(duì)接結(jié)果分析得出PTGS2與香豆雌酚對(duì)接時(shí)未能找到結(jié)合位點(diǎn),故予以剔除;ATF3與香豆雌酚的結(jié)合能最低,為-5. 5874kJ/mol,表明該配體與受體的構(gòu)象最為穩(wěn)定(表1)。具體對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

圖6 活性成分-靶點(diǎn)圖

表1 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)間的最低結(jié)合能

圖7 分子對(duì)接2D結(jié)果圖A、B、D:分別為檸檬酸與靶點(diǎn)PTGS2、ATF3、GPT2對(duì)接圖;C、E:分別為香豆雌酚與靶點(diǎn)GPT2、ATF3對(duì)接圖

圖8 天然小分子與靶點(diǎn)分子對(duì)接3D圖

討 論

CKD是由各種不同因素而導(dǎo)致的腎臟的不可逆性結(jié)構(gòu)和功能障礙,若未得到有效救治,患者可能快速進(jìn)展至ESRD,危及生命安全。而在近幾年的研究中表明,鐵死亡在CKD領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用,Ferrostatin-1可能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和促進(jìn)GPX4表達(dá)而抑制纖維化發(fā)展[14]。最近一項(xiàng)研究表明,在葉酸所致的腎損傷中,羅沙司他能夠通過(guò)抑制鐵死亡減輕腎損傷及腎纖維化[15],通過(guò)干預(yù)鐵死亡或能成為治療CKD的新途徑。在目前研究中,鐵死亡相關(guān)誘導(dǎo)劑和抑制劑在治療CKD中取得了一定進(jìn)展,但是絕大多數(shù)仍然停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,向臨床轉(zhuǎn)化以及開發(fā)新型精準(zhǔn)藥物值得期待。相關(guān)研究表明許多天然藥物在治療CKD上具有一定療效[16],但其具體作用成分仍不明確。通過(guò)明確鐵死亡與CKD共同的表達(dá)靶點(diǎn)并定位其具體天然藥物成分,可為CKD的治療帶來(lái)創(chuàng)新。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選得到可能從鐵死亡角度治療CKD的18個(gè)核心靶點(diǎn),分別為PLIN4、ATF3、PCK2、ANGPTL7、TSC22D3、MIOX、ACSF2、PTGS2、DUSP1、CBS、DDIT4、FLT3、TAZ、SLC3A2、ALB、GPT2、LPIN1、HBA1。GO分析顯示其生物過(guò)程包括小分子分解代謝過(guò)程,細(xì)胞糖皮質(zhì)激素刺激的反應(yīng)以及抗氧化活性等。有研究表明,腎臟氧自由基的產(chǎn)生及清除失衡是CKD發(fā)生發(fā)展眾多因素中的一種重要致病機(jī)制[17],本研究也發(fā)現(xiàn),顯著性DEGs主要富集在氧結(jié)合及抗氧化過(guò)程,提示腎臟缺氧可能會(huì)促進(jìn)CKD的發(fā)生。KEGG分析顯示核心基因主要富集在mTOR、PPAR等相關(guān)信號(hào)通路。mTOR信號(hào)通路的激活被證實(shí)是miRNA激活的主要反應(yīng)性元素,在腎臟疾病進(jìn)展中起著重要的作用[18]。在衰老過(guò)程中,受損的腎臟PPAR信號(hào)過(guò)表達(dá)會(huì)加重腎纖維化的發(fā)展[19]。結(jié)合上述已有的研究結(jié)果表明,本研究所預(yù)測(cè)的信號(hào)通路異常表達(dá)與CKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),針對(duì)上述信號(hào)通路開展靶向治療可能具有較好的可行性。

采用STRING及Cytoscape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CKD關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,以尋找靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系,在18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相互作用蛋白中,度值排名最高的基因?yàn)锳LB,排名最低的基因?yàn)锳CSF2,其中僅FLT3為上調(diào)基因,其余17關(guān)鍵靶點(diǎn)均為下調(diào)基因。再由中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步得到了CKD的DEGs和預(yù)測(cè)藥物共同靶點(diǎn):PTGS2、ATF3、GPT2。有研究表明,在腎衰竭期間,PTGS2mRNA和蛋白質(zhì)水平及酶活性一起增加。此外,PTGS2表達(dá)的變化與血壓、尿量、蛋白質(zhì)的增加及尿滲透壓降低有關(guān)[20]。ATF3參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程,一項(xiàng)體外研究表明,MCP-1在上皮細(xì)胞中的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的遷移受到含有上皮來(lái)源ATF3mRNA的外泌體所抑制,并且在這些外泌體表達(dá)后腎臟缺血/再灌注誘導(dǎo)的腎損傷減弱[21];近期另一項(xiàng)研究提示白蛋白誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特征與ATF3/ATF4活化相關(guān),ATF3和ATF4誘導(dǎo)通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)Klotho,消除了增加的蛋白質(zhì)[22]。GPT2在許多組織中的糖異生和氨基酸代謝中起作用,包括骨骼肌,腎臟和肝臟。最近的研究發(fā)現(xiàn)GPT2在人AML細(xì)胞HL60中參與腫瘤細(xì)胞的增殖、周期分布以及細(xì)胞的凋亡,GPT基因的敲減會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖抑制以及凋亡增加[23]。

通過(guò)symMap數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶向作用于CKD致病基因的中藥進(jìn)行篩選,并進(jìn)一步通過(guò)TCMSP預(yù)測(cè)最有可能治療CKD的天然小分子藥物:檸檬酸、香豆雌酚,其來(lái)源于大黃、蘆薈、虎杖、葛花等中藥。在最近的幾項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),檸檬酸可減少腸道中病原微生物負(fù)荷,從而改善腸道菌群功能[24],CKD患者由于毒素在體內(nèi)的蓄積,破壞了腸道上皮功能,激活了腸道的免疫調(diào)節(jié),使得有害物質(zhì)入血,誘導(dǎo)全身性的病變,最終損害腎臟,形成惡性循環(huán)[25],而檸檬酸通過(guò)穩(wěn)定腸道菌群,減少腸源性尿毒素的蓄積,延緩CKD進(jìn)展,發(fā)揮腎臟保護(hù)的作用。近些年香豆雌酚在多種疾病中展現(xiàn)出藥用潛力,其表現(xiàn)出廣泛的藥理活性,包括抗炎、器官保護(hù)、抗氧化等[26];有研究表明香豆雌酚對(duì)CKD具有保護(hù)作用,能夠抑制雌激素受體β陽(yáng)性細(xì)胞,從而影響腎臟組織某些生物酶的活性,促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖、炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)積聚以及腎間質(zhì)纖維化。最后通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證的通過(guò)鐵死亡機(jī)制治療CKD的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)間具有良好的結(jié)合活性。

綜上所述,本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析得到了從鐵死亡角度治療CKD的靶點(diǎn)及天然藥物成分,為今后闡明天然藥物成分對(duì)基因間的調(diào)控機(jī)制、協(xié)助預(yù)防和治療CKD提供關(guān)鍵的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐,也為后續(xù)更深入研究CKD的中醫(yī)藥療法奠定前期基礎(chǔ)。