趙 越 張明超 梁少姍 秦衛(wèi)松 劉志紅

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種以免疫異?；罨痛罅孔陨砜贵w產(chǎn)生為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,臨床表現(xiàn)為多器官受累。狼瘡性腎炎(LN)是SLE最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,即便接受免疫抑制劑治療,仍有10%～20%的 LN患者進(jìn)展至終末期腎病(ESRD)[1]。因此,尋找新療法控制LN免疫炎癥反應(yīng)對LN的臨床治療具有重要意義。

本中心在國際上首次提出“多靶點”療法(MT)并牽頭組織完成了國際上首個多中心隨機(jī)對照臨床研究(RCT),證實MT療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)療法[2-3], 目前MT療法已被多個國際權(quán)威指南推薦并推廣至全球多個國家和地區(qū),為LN治療提供了新策略。我們前期的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),與單藥相比MT能夠特異性抑制狼瘡小鼠腎組織白細(xì)胞介素6(IL-6)/信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)信號通路[4],既往研究證實IL-6可作為重要炎癥介質(zhì)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子STAT3促進(jìn)狼瘡疾病進(jìn)展,提示靶向抑制IL-6/STAT3信號可能是LN新藥發(fā)現(xiàn)的有效途徑。

白楊素(CHR)是一類天然黃酮,廣泛存在于蜂膠、西番蓮和蜂蜜等植物中[5]。近年來CHR的抗炎作用越發(fā)受到關(guān)注,Ha等[6]發(fā)現(xiàn)CHR可通過調(diào)控核因子κB(NF-κB)信號抑制巨噬細(xì)胞中干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子分泌,Lin等[7]研究發(fā)現(xiàn)CHR能夠有效抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中的 IL-6/STAT3信號通路。上述研究提示CHR具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性,可能通過抑制IL-6/STAT3信號在LN中發(fā)揮療效。本研究采用經(jīng)典的自發(fā)性狼瘡小鼠模型MRL/lpr對CHR在LN中的療效及其機(jī)制進(jìn)行探究,結(jié)果將為狼瘡藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

材料

實驗動物 雌性MRL/lpr小鼠和C57BL/6小鼠均購自江蘇艾凌菲生物科技有限公司。

主要試劑 CHR(Sigma);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,selleck);RNA提取試劑盒(Takara);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara);實時熒光定量PCR (RT-qPCR)試劑盒(ABI);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天);p-STAT3抗體(CST);STAT3抗體(proteintech);β-actin抗體(proteintech);酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(R&D)。

方法

實驗分組 將12只雌性MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為疾病組和CHR治療組(每組n=6),選取6只同周齡雌性C57BL/6小鼠作為正常對照。治療組從10周齡開始給藥,每天口服飼喂CHR(160 mg/kg),持續(xù)給藥8周。疾病組和正常對照組小鼠均給予等量溶劑處理。各組小鼠于18周齡時處死,采集脾臟、尿液、血液及腎組織樣本進(jìn)行后續(xù)檢測。

過碘酸-雪夫(PAS)染色小鼠處死后取腎組織,置于4%的多聚甲醛中固定,乙醇洗脫后進(jìn)行石蠟包埋,制備成3 μm厚度切片進(jìn)行PAS染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

RT-qPCR將腎組織樣本勻漿后參照Takara試劑盒說明抽提總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)合成cDNA,利用SYBER Green法進(jìn)行RT-qPCR檢測腎組織中IL-6的mRNA表達(dá)水平。

蛋白免疫印跡(WesternBlot)RIPA裂解液抽提各組小鼠腎組織蛋白,經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液,95 ℃變性5 min。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE膠電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印,脫脂奶粉封閉及一抗、二抗孵育后,滴加化學(xué)發(fā)光液后利用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照,Image plus pro(IPP)軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。

尿蛋白/肌酐檢測分別用Albuwell M 和 Creatinine companion kits(Exocell Laboratories)測定各組小鼠尿蛋白及尿肌酐,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

ELISA檢測血清IL-6水平麻醉后摘取小鼠眼球,用1.5 ml EP管收集小鼠全血,1500 g離心10 min后取上清,參照R&D試劑盒說明檢測血清中IL-6分泌水平。

統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用《Graphpad Prism 8》軟件進(jìn)行圖表制作及數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用Dunnett法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

CHR減輕狼瘡小鼠脾臟重量及脾臟指數(shù)8周后處死各組小鼠發(fā)現(xiàn)，與正常對照組小鼠比較,MRL/lpr疾病組小鼠脾重及脾臟指數(shù)(脾重/體重)均顯著上升,給予CHR治療后可顯著下調(diào)小鼠脾重及脾臟指數(shù),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A、B)。

CHR緩解狼瘡小鼠蛋白尿水平既往研究發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡小鼠模型隨周齡增加疾病逐漸進(jìn)展,在16周即可出現(xiàn)明顯腎臟受累[8]。本研究通過ELISA檢測各組小鼠蛋白尿肌酐比值(ACR)發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比MRL/lpr組小鼠ACR水平明顯上調(diào),而給予CHR治療8周后能夠有效緩解LN小鼠蛋白尿肌酐比值(圖1C)。

圖1 CHR對MRL/lpr小鼠脾重(A)、脾臟指數(shù)(B)及蛋白尿(C)的影響MRL/lpr:狼瘡疾病組;CHR:白楊素治療組；ACR：蛋白尿肌酐比值;**P<0.01

CHR緩解狼瘡小鼠腎臟病理損傷程度在光鏡下觀察各組小鼠腎組織PAS染色切片,發(fā)現(xiàn)MRL/lpr小鼠腎小球體積明顯增大,呈彌漫性系膜細(xì)胞增生,嚴(yán)重者可見腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化形成,CHR治療可明顯緩解上述病變(圖2A),對PAS染色結(jié)果進(jìn)行病理損傷定量分析后發(fā)現(xiàn)，CHR治療可下調(diào)狼瘡疾病組小鼠腎小球損傷評分(圖2B)。以上結(jié)果提示CHR能夠有效緩解MRL/lpr小鼠模型腎損傷。

圖2 CHR治療緩解MRL/lpr小鼠腎臟病理損傷PAS:過碘酸-雪夫染色;MRL/lpr:狼瘡疾病組;CHR:白楊素治療組；A:CHR治療可緩解MRL/lpr組小鼠系膜增生及腎間質(zhì)損傷(PAS，×1 000);B:根據(jù)PAS染色結(jié)果對各組小鼠腎損傷程度進(jìn)行組織學(xué)評分;**P<0.01

CHR下調(diào)循環(huán)及腎組織炎癥因子IL-6水平我們前期研究結(jié)果顯示IL-6信號活化是LN疾病進(jìn)展的重要誘發(fā)因素,MT治療能夠有效抑制IL-6/STAT3信號并顯著緩解MRL/lpr狼瘡小鼠的腎小球炎癥反應(yīng)[4]。通過ELISA實驗和qPCR實驗檢測循環(huán)IL-6的分泌情況及腎組織局部IL-6 mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比,MRL/lpr小鼠循環(huán)及腎組織IL-6水平均顯著上調(diào),給予CHR治療顯著抑制IL-6表達(dá)及分泌(圖3)。

圖3 CHR抑制MRL/lpr小鼠循環(huán)及腎組織中IL-6水平IL-6:白細(xì)胞介素6;MRL/lpr:狼瘡疾病組;CHR:白楊素治療組。A:ELISA檢測各組小鼠血清中IL-6水平;B:qPCR檢測各組小鼠IL-6 mRNA水平,**P<0.01

CHR抑制MRL/lpr小鼠腎組織IL-6/STAT3信號活化為進(jìn)一步探究CHR對MRL/lpr小鼠腎組織STAT3表達(dá)的影響,我們在8周給藥結(jié)束后收集各組小鼠腎組織樣本檢測STAT3信號活化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,MRL/lpr小鼠腎組織p-STAT3表達(dá)顯著上調(diào)且呈彌漫性分布,CHR給藥能夠顯著抑制其表達(dá)水平(圖4)。以上結(jié)果提示CHR可能通過抑制IL-6/STAT3信號異?；罨徑釲N小鼠腎損傷。

討 論

LN是我國繼發(fā)性腎小球腎炎最常見的病因,約20%的LN患者會進(jìn)展至ESRD[1]。LN的治療目標(biāo)是通過誘導(dǎo)期及維持期的治療實現(xiàn)臨床緩解,目前臨床主要以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑作為一線治療用藥,盡管能夠一定程度上延緩疾病進(jìn)展并提高患者生存率,但其完全緩解率仍舊偏低[9]。本中心在國際上首次提出“多靶點”的治療理念,建立了激素、嗎替麥考酚酯和他克莫司聯(lián)合的MT療法并應(yīng)用于LN治療。中心牽頭組織并完成了國際上首個多中心RCT證實MT療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)療法,進(jìn)一步通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)MT能夠特異性抑制MRL/lpr狼瘡小鼠腎組織中IL-6/STAT3信號通路活化[4]。既往研究證實IL-6是狼瘡疾病進(jìn)展的重要炎性介質(zhì),IL-6分泌增加可迅速活化STAT3信號通路,STAT3的活性在正常生理狀態(tài)下受到嚴(yán)格的調(diào)控,但在狼瘡疾病狀態(tài)下可出現(xiàn)異常激活,而過度激活的STAT3也會誘導(dǎo) IL-6 產(chǎn)生,從而形成反饋環(huán)路加劇疾病進(jìn)展[10-11]。因此,靶向抑制IL-6/STAT3 的化合物很可能成為治療LN的潛在藥物。

圖4 CHR抑制狼瘡小鼠腎組織IL-6/STAT3信號MRL/lpr:狼瘡疾病組;CHR:白楊素治療組;STAT3:信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3;p-STAT3:磷酸化STAT3；A:Western Blot檢測各組小鼠腎組織p-STAT3水平;B: IHC檢測各組小鼠p-STAT3表達(dá)及分布

黃酮類化合物又被稱為生物類黃酮,是人類飲食中發(fā)現(xiàn)的最豐富的多酚類化合物,目前已鑒定出5 000余種不同的黃酮類化合物[12]。CHR是一種具有15碳骨架的類黃酮,廣泛存在于西番蓮、蜂蜜、蜂膠等植物中,具有多種生物學(xué)活性。已有研究報道CHR能夠在阿霉素所致腎損傷、腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠慢性腎炎模型及糖尿病腎病小鼠模型中發(fā)揮療效[13-15],但其在LN中的作用尚無研究報道。CHR能夠抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多個腫瘤進(jìn)展[16],機(jī)制主要為誘發(fā)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、改善脂質(zhì)過氧化和抗氧化狀態(tài)、抑制血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等[17-18]。近年來隨著研究深入,人們發(fā)現(xiàn)CHR除抗腫瘤作用之外還具有強大的抗炎作用,能夠抑制INF-γ和TNF-α等炎癥因子水平[19],影響前列腺素E2、環(huán)氧合酶2(COX-2)和NF-κB等炎癥信號通路[20-21],值得注意的是,Darwish等[22]利用小鼠模型證實CHR治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有效,齊世美等[23]報道 CHR能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞中IL-6/STAT3信號通路抑制炎癥反應(yīng)?；谝陨涎芯?我們推測CHR可能通過抑制狼瘡小鼠腎組織中IL-6/STAT3信號通路在LN中發(fā)揮療效。

本研究中,我們利用MRL/lpr狼瘡小鼠模型探究 CHR在LN中的療效,給予MRL/lpr小鼠CHR治療8周后發(fā)現(xiàn)狼瘡小鼠脾重及脾臟指數(shù)較疾病組均明顯降低,提示CHR能夠緩解狼瘡鼠全身免疫活化狀態(tài)。進(jìn)一步檢測各組小鼠蛋白尿水平和腎組織病理學(xué)改變發(fā)現(xiàn)CHR治療顯著緩解MRL/lpr小鼠腎臟局部損傷。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)CHR可抑制狼瘡小鼠循環(huán)IL-6分泌及腎組織IL-6 mRNA表達(dá)水平并下調(diào)腎組織中p-STAT3水平,提示CHR治療能夠抑制狼瘡小鼠腎組織中異?；罨腎L-6/STAT3信號緩解LN疾病表型,本研究結(jié)果表明CHR等黃酮類化合物在LN等自身免疫性疾病治療中具有極其廣闊的應(yīng)用前景。