肖遠(yuǎn)

羅田縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北黃岡 438600

呼吸系統(tǒng)類感染疾病是目前世界公認(rèn)影響人類健康的主要疾病之一，據(jù)有關(guān)調(diào)查提示，全球每年死于呼吸系統(tǒng)感染疾病的人數(shù)占總死亡人數(shù)的1/3[1]。從臨床對(duì)引發(fā)肺炎的病原體調(diào)查情況來(lái)看，近幾年來(lái)以肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae,MP）為代表的病原體其占據(jù)的位置越來(lái)越重要，也有報(bào)道指出MP就是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎的主要致病原[2]。人類本身就對(duì)MP具有易感性，因此MP在全球范圍內(nèi)均有流行，因感染MP而發(fā)病的人數(shù)也有逐年升高趨勢(shì)，加上支原體肺炎臨床癥狀嚴(yán)重、診治困難等特點(diǎn)，因此成為目前臨床最為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一[3]。為了提高臨床對(duì)MP的檢出率，本文就LAMP、PCR兩種檢驗(yàn)方法的應(yīng)用價(jià)值展開研究分析，以2020年1月—2021年3月期間羅田縣人民醫(yī)院診治并確診為支原體肺炎的500例患者為例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取到本院內(nèi)兒科接受診治并確診為支原體肺炎的患者，其中男335例，女165例；年齡7～62歲，平均（28.6±7.4）歲。由本院相關(guān)專業(yè)護(hù)士采用一次性咽拭子采集管對(duì)所有患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行采集，采集完畢后所有咽拭子標(biāo)本均送入本院檢驗(yàn)科保存于-80℃的冰箱內(nèi)。由檢驗(yàn)科人員將患者咽拭子標(biāo)本中MP的DNA提取出，并對(duì)其進(jìn)行LAMP、PCR檢驗(yàn)。本次研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者及其家屬同意。

1.2 方法

所有患者的咽拭子標(biāo)本均由專用的一次性咽拭子收集管進(jìn)行收集，對(duì)患者的分泌物進(jìn)行收集后將其置入2 mL的塑料離心管(eppendorf,EP)管內(nèi)，隨即在其中加入300μl的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS），將溶液與患者分泌物進(jìn)行漩渦處理（10 min），處理完成后取試管上清物300 μl備用[4]。首先對(duì)所有患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，再將其裝入MP-DNA的專用試劑盒內(nèi)，DNA提取步驟詳細(xì)操作如下所示。

利用提前準(zhǔn)備好的GD緩沖液和PW緩沖液加入無(wú)水乙醇進(jìn)行融合混合處理，然后在已經(jīng)開始發(fā)生沉淀的液體中緩緩加入GA緩沖液，完畢后使用振蕩器將其充分震蕩直至徹底懸浮為止[5]。將之前與患者分泌物充分融合的PBS溶液拿出并取出其中經(jīng)漩渦處理后懸浮的沉淀物1 mL，對(duì)這些沉淀物進(jìn)行離心處理（1 000 rpm，1 min），注意取液時(shí)一定要盡量將上清液吸取干凈[6]。將蛋白酶K放入溫水中進(jìn)行溫?zé)?，時(shí)間為2 min，溫浴完畢后加入到之前放入EP管的分泌物中，加入量為20μl，并將蛋白酶K與其充分混合，直到完全均勻?yàn)橹筟7]。再向混合均勻的EP管內(nèi)逐漸加入緩沖液GB，震蕩EP管20 s左右，然后將其放在47℃的環(huán)境內(nèi)進(jìn)行保存，放置時(shí)間為20 min左右，肉眼可見EP管內(nèi)的溶液變得清亮即可，再將因離心操作而在管內(nèi)壁上形成的水珠擦拭干凈[8]。將上一步得到了溶液全部注入吸附柱CB3中，對(duì)其進(jìn)行離心處理（12 000 rpm，10 s），完成后將里面的廢液倒掉，最后再將其放入收集管內(nèi)[9]。在試劑盒內(nèi)的吸附柱CB3中加入緩沖液GD 500μl，再對(duì)其進(jìn)行離心處理（12 000 rpm，30 s），結(jié)束后，倒掉其中的廢液，再將其放入收集管。將上步操作所得CB3內(nèi)加入PW緩沖液700 μl，之后進(jìn)行離心處理（12 000 rpm，30 s），倒掉廢液收回收集管。將上步所得CB3加入PW緩沖液500μl，離心處理（12 000 rpm，30 s），倒掉廢液放回收集管。將上一步所得CB3放回收集管后10 min左右，將產(chǎn)生的吸附材料全部清理掉，并將殘余的清洗液體晾干，再進(jìn)行離心處理（12 000 rpm，10 min），處理完畢后將其中的廢液倒掉，打開吸附柱CB3的蓋子并將其放在室溫下靜置[10]。準(zhǔn)備一個(gè)干凈的離心管，并將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入其中，在其吸附膜的中間懸空位置滴入TE洗脫液（100μl），在室溫下靜置5 min，靜置完畢后進(jìn)行離心處理（12 000 rpm，2 min），最后將所有離心處理后的溶液進(jìn)行收集存放[11]。

兩種不同檢驗(yàn)方法的具體實(shí)施內(nèi)容如下：①PCR檢驗(yàn)。在標(biāo)本內(nèi)加入純水至25 mL，PCR檢驗(yàn)方法需要在94℃的高溫下進(jìn)行預(yù)熱，再將溫度調(diào)至55℃進(jìn)行退火，最后在68℃下進(jìn)行延伸。將上述步驟循環(huán)30次，待標(biāo)本充分反應(yīng)后收集所得產(chǎn)物，對(duì)其實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳（2%）[12]。為了保證PCR反應(yīng)充分，本次研究中將退火溫度設(shè)置為55～58℃之間，以求標(biāo)本可以在最適宜的退火溫度下進(jìn)行。PCR檢驗(yàn)所需藥品及用量：10*buffer（2.5 μl）、dNTP（2.0μl）、上引物（2.0μl）、下引物（1.0μl）、DNA模板（4.0μl）、酶（0.15μl）[13]。

②LAMP檢驗(yàn)。以25 μl的總體積標(biāo)本液對(duì)其進(jìn)行加熱處理，加熱時(shí)間為2 min，此操作主要是為了讓MP的DNA充分解鏈，然后再將標(biāo)本液置入冰水中進(jìn)行浸泡，時(shí)間為3 min，隨即向其中加入8 U BstDNA聚合酶[14]。在62℃的恒溫環(huán)境下讓其進(jìn)行充分反應(yīng)（60 min），反應(yīng)結(jié)束后再將溫度調(diào)整到80℃，并對(duì)其進(jìn)行加熱處理（3 min），讓聚合酶徹底變性，對(duì)反應(yīng)后剩余的產(chǎn)物進(jìn)行觀察分析。為了優(yōu)化LAMP反應(yīng)，本次操作中設(shè)定了58℃、60℃、62℃以及64℃4個(gè)溫度梯度。LAMP反應(yīng)所需藥品有AMpbuffer（2.5 μl）、dNTP（4 μl）、Mg2+（6 μl）、Betaine（4.5μl）、Loop（1μl）、LIP（1μl）、F3（1μl）、BIP（1μl）、B3（1μl）。

特異性檢測(cè)：為了保證本次實(shí)驗(yàn)的特異性檢出準(zhǔn)確度，在實(shí)驗(yàn)完成后再選取院內(nèi)其他幾種常見的呼吸道疾病致病原進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，并利用瓊脂糖凝膠電泳（2%）進(jìn)行鑒定，對(duì)最后的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并通過計(jì)算機(jī)掃描計(jì)算檢驗(yàn)標(biāo)本的片斷跑膠情況。

靈敏度檢測(cè)：選取同樣數(shù)量的陽(yáng)性病例作為檢測(cè)的母本，并將咽拭子中的MP-DNA按上述方式提取出，利用分光光度對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)計(jì)算，得出該陽(yáng)性模板的DNA濃度，再將其稀釋10倍，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2%），觀察最后的跑膠結(jié)果，若在10-1、10-2、10-3各個(gè)梯度上都沒能夠?qū)ζ溥M(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，那么即可判定其為該梯度上一級(jí)為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的極限梯度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢驗(yàn)方式檢出陽(yáng)性率對(duì)比

兩種檢驗(yàn)方法的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種檢驗(yàn)方法檢出陽(yáng)性率情況對(duì)比

2.2 兩種檢驗(yàn)方法特異性對(duì)比

對(duì)肺炎常見病原體（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、糞腸桿菌、肺炎支原體等）DNA進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖1，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及糞腸桿菌在0～100 min內(nèi)均未發(fā)生顯著的熒光富集，這說(shuō)明本方法在等溫條件下肺炎支原體的檢測(cè)特異性較高，可以進(jìn)行推廣應(yīng)用。見圖1。

圖1 兩種檢驗(yàn)方法的特異性結(jié)果

2.3 兩種檢驗(yàn)方法靈敏度對(duì)比

為了考察本檢測(cè)方法的靈敏度，將肺炎支原體DNA進(jìn)行梯度稀釋。在10-1、10-2、10-3各個(gè)梯度1稀釋區(qū)間，產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)的時(shí)間隨著濃度降低逐漸推移，呈現(xiàn)很好變化趨勢(shì)。因此利用靶標(biāo)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)和其擴(kuò)增熒光信號(hào)的Cq作一次函數(shù)，并得出其對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)公式為Cq=60147-6881gA（mol）（A表示檢測(cè)靶標(biāo)的物質(zhì)的量，R2=0.971 4），其線性范圍跨度3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)范圍寬。

3 討論

MP可在各個(gè)年齡段人群內(nèi)發(fā)生感染，因此對(duì)于各個(gè)年齡階段的人群來(lái)說(shuō)其都是一個(gè)非常重要的病原體，有大概率會(huì)引發(fā)人體發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道疾病。據(jù)臨床有關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，社區(qū)獲得性肺炎中因MP所引起的支原體肺炎（mycoplasma pneumonia,MPP）占所有肺炎發(fā)病患者數(shù)量的20%～45%之間，且近年來(lái)此占比還有不斷上升的趨勢(shì)[15]。除了臨床常見的呼吸道感染疾病之外，人體感染MP之后可能還會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)人體的多個(gè)器官發(fā)生肺外并發(fā)癥，臨床中最常見的并發(fā)癥就有溶血性貧血、腎炎，癥狀嚴(yán)重且未能得到有效治療的患者還會(huì)有致死風(fēng)險(xiǎn)。MP的傳播途徑主要為口鼻飛沫，且兒童感染的概率會(huì)比青年人和老年人更大，且春夏秋冬都可發(fā)作，沒有地域性差異，以秋冬季節(jié)為主要發(fā)病時(shí)期，每3年左右就會(huì)流行一次[16]。MP好發(fā)于人口密集場(chǎng)所，比如學(xué)校、醫(yī)院等人口密集的場(chǎng)所發(fā)生MP感染的情況要明顯多于其他人口稀疏的場(chǎng)所。如果MPP早期未得到有效檢出，那么其除了可引發(fā)患者肺部損傷之外，還可能會(huì)繼發(fā)損害患者體內(nèi)的其他系統(tǒng)，常見的受損系統(tǒng)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)[17]。

目前MP檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)為分離培養(yǎng)，MP分離培養(yǎng)雖然可以極大程度地檢測(cè)出MP，但培養(yǎng)的條件非常苛刻，且MP本身的生長(zhǎng)速度緩慢，因此一般需要進(jìn)行3 d左右的分離培養(yǎng)操作才能顯現(xiàn)出MP典型的菌落群形狀，因此并不適用于臨床快速檢驗(yàn)MP。PCR和LAMP是目前臨床實(shí)驗(yàn)室中較常見的檢驗(yàn)方法，其中PCR研究發(fā)展最為成熟，通過合理設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)判斷患者是否被MP感染，以此能有效地檢出MP，但PCR所需設(shè)備比較昂貴，對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求也非常高，雖然其檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性得到了廣泛認(rèn)可，但卻并沒有得到推廣。LAMP是目前臨床新發(fā)展的一種檢驗(yàn)方法，臨床有醫(yī)學(xué)研究對(duì)當(dāng)?shù)? 702例肺炎患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可見這些患者通過LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性率（91.37%）要高于通過PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率（79.53%）[18]。從本次研究的結(jié)果來(lái)看，LAMP檢驗(yàn)陽(yáng)性檢出率91.2%高于PCR檢驗(yàn)陽(yáng)性檢出率80.6%（P＜0.05），與其他臨床對(duì)LAMP和PCR檢驗(yàn)方法的研究結(jié)果基本一致，LAMP只需要恒溫水浴鍋即可滿足檢驗(yàn)要求，其反應(yīng)產(chǎn)生物更是可以直接用肉眼觀察判斷，省去了PCR反應(yīng)后還需要繼續(xù)進(jìn)行跑膠的步驟，進(jìn)一步加快了檢驗(yàn)的速度。

綜上所述，本研究中，發(fā)現(xiàn)LAMP檢驗(yàn)方法較PCR特異性、敏感度都更高，因此得出結(jié)論：LAMP檢驗(yàn)方法檢測(cè)MP更加敏感，且其只需要進(jìn)行很短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，因此有較理想的發(fā)展應(yīng)用前景。但不可忽視的是其反應(yīng)所需溫度環(huán)境要求較高，因此還需要臨床不斷進(jìn)行研究和探索，克服其存在的這些問題。