丁濤，張強(qiáng)

延安市人民醫(yī)院骨科，陜西 延安 716000

骨肉瘤是臨床常見的非血液系統(tǒng)原發(fā)性骨腫瘤，任何年齡段均可發(fā)病，但多見于青少年[1]。骨肉瘤好發(fā)于四肢長骨的干骺端，如股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端等部位，易在早期出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，進(jìn)展快，預(yù)后差。疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙和肌肉萎縮為骨肉瘤常見的臨床表現(xiàn)，且隨著腫瘤的轉(zhuǎn)移還可影響患者呼吸系統(tǒng)等多個(gè)重要系統(tǒng)的功能。隨著新輔助化療技術(shù)的發(fā)展，保肢手術(shù)聯(lián)合新輔助化療在骨肉瘤的治療中取得了較為理想的效果，但由于骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的多因性和復(fù)雜性，如何對骨肉瘤進(jìn)行早期診斷、鑒別診斷、尋找臨床預(yù)后的分子標(biāo)志物成為臨床面臨的難點(diǎn)[2]。研究指出，集落刺激因子 1（colony-stimulating factor 1，CSF1）、肺癌食管癌缺失基因1（deleted in lung and esophageal cancer 1，DLEC1）、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3-4]，但目前關(guān)于CSF1、DLEC1、PTEN對骨肉瘤細(xì)胞增殖及患者預(yù)后影響的研究較少。因此，本研究探討CSF1、DLEC1、PTEN在骨肉瘤患者中的表達(dá)及對患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2019年2月延安市人民醫(yī)院收治的骨肉瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為骨肉瘤；②經(jīng)影像學(xué)檢查明確無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③既往未進(jìn)行任何治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②存在肝腎功能嚴(yán)重障礙；③妊娠期女性；④存在嚴(yán)重感染性疾病、血液系統(tǒng)疾??；⑤合并精神疾病，依從性差；⑥隨訪資料不完整。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入62例骨肉瘤患者，其中男37例，女25例；年齡12～63歲，平均（24.38±5.19）歲；分化程度：低分化26例，中分化20例，高分化16例；Enneking分期：ⅡA期24例，ⅡB期38例。另選取同期延安市人民醫(yī)院收治的軟骨瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為軟骨瘤；②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤；②存在肝腎功能嚴(yán)重障礙；③存在嚴(yán)重感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入43例軟骨瘤患者，其中男28例，女15例；年齡15～71歲，平均（26.29±4.53）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測CSF1、DLEC1、PTEN蛋白的表達(dá)情況

取62例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織和43例軟骨瘤患者的軟骨瘤組織，10%甲醛固定，組織切片后脫蠟、水化。采用免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-過氧 化 物 酶（streptavidin-peroxidase，SP）法 檢 測CSF1、DLEC1、PTEN蛋白的表達(dá)情況，兔抗人CSF1多克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)公司，兔抗人DLEC1多克隆抗體購自Proteintech公司，兔抗人PTEN多克隆抗體購自福建邁新生物工程有限公司，試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均由河北博海生物工程開發(fā)有限公司提供。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，檢測完成后由2名高年資醫(yī)師采用雙盲法閱片。依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定[5-6]：無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占比例10%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例＞50%計(jì)3分；無著色計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2分，棕褐色染色計(jì)3分。將陽性細(xì)胞所占比例評分和染色強(qiáng)度評分相乘，≤3分判定為陰性，≥4分判定為陽性。

1.3 隨訪

采用電話或定期門診復(fù)查的方式對骨肉瘤患者進(jìn)行為期2年的隨訪，記錄骨肉瘤患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估 CSF1、DLEC1、PTEN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對骨肉瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF1、DLEC1、PTEN表達(dá)情況的比較

骨肉瘤組織中CSF1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于軟骨瘤組織，DLEC1、PTEN蛋白的陽性表達(dá)率均明顯低于軟骨瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 骨肉瘤組織和軟骨瘤組織中CSF1、DLEC1、PTEN蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 CSF1、DLEC1、PTEN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對骨肉瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

隨訪2年，62例骨肉瘤患者死亡23例，生存39例，總生存率為62.90%（39/62）。ROC曲線顯示，CSF1+DLEC1+PTEN檢測預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的AUC為0.886（95%CI：0.802～0.970），高于三者單獨(dú)檢測。（表2、圖1）

表2 CSF1、DLEC1、PTEN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對骨肉瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

圖1 CSF1、DLEC1、PTEN單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

骨肉瘤是較為常見的間葉組織原發(fā)惡性骨腫瘤，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，骨肉瘤發(fā)病例數(shù)占骨腫瘤的20.0%，占惡性骨腫瘤的76.2%[7]。目前骨肉瘤的病因尚未明確，相關(guān)研究顯示，下肢負(fù)重骨在射線、遺傳、病毒感染、急性型骨炎等因素的誘發(fā)下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生突變，從而形成腫瘤[8]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尋求骨肉瘤生物學(xué)特性相關(guān)的分子靶點(diǎn)成為治療骨肉瘤的新突破[9]。

本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中CSF1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于軟骨瘤組織，DLEC1、PTEN蛋白的陽性表達(dá)率均明顯低于軟骨瘤組織，表明CSF1、DLEC1、PTEN參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程，可作為骨肉瘤的早期預(yù)測指標(biāo)。CSF1是一種具有譜系特異性的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞等[10]。CSF1不僅能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的增殖分化，且在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移、促進(jìn)腫瘤新生血管生成等[11]。DLEC1具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DLEC1在前列腺癌的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)明顯缺失或下調(diào)，去甲基化后可以恢復(fù)表達(dá)，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長、抑制集落形成并降低細(xì)胞的侵襲性[12]。PTEN是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因突變被證實(shí)與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，PTEN缺失、突變可降低磷酸酶活性，強(qiáng)化腫瘤細(xì)胞的增殖能力[13]。相關(guān)研究指出，部分細(xì)胞因子在腫瘤細(xì)胞遷移侵襲及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。且進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果顯示，CSF1+DLEC1+PTEN檢測預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的AUC為0.886（95%CI：0.802～0.970），高于三者單獨(dú)檢測。提示CSF1、DLEC1、PTEN可作為骨肉瘤患者預(yù)后評估的重要指標(biāo)，可將上述指標(biāo)聯(lián)合檢測用于輔助性評估骨肉瘤患者的預(yù)后。

綜上所述，骨肉瘤組織中CSF1陽性表達(dá)率較高 ，DLEC1、PTEN陽性表達(dá)率較低，CSF1、DLEC1、PTEN聯(lián)合檢測對骨肉瘤患者的預(yù)后有一定的評估價(jià)值。